Слабый сайт: 8 самых ужасных сайтов мира / Хабр

Содержание

8 самых ужасных сайтов мира / Хабр

В блоге Name.com был опубликован рейтинг самых ужасных сайтов мира. Среди этих сайтов есть просто безобразные, есть почти неюзабельные, а некоторые могут служить эталоном банальности и неинтересности.

По мнению автора блога, эти сайты настолько отвратительны, что их авторы, должно быть, создавали их под влиянием тяжелых наркотиков. Поэтому, если вы считаете, что дизайн вашего сайта недостаточно профессионален, или же ему не хватает оригинальности и разнообразия, вы можете поднять свою самооценку, взглянув на восемь самых ужасных сайтов в Интернете.

1. MIA UK

http://www.miauk.com/

Если у вас еще не заболела голова после просмотра стартовой страницы, продолжайте навигацию по сайту.
Страницы с огромным количеством долго загружающихся элементов и ссылки, ведущие в никуда, заставят вас рвать на себе волосы. Ужасное сочетание ядовито-зеленого и ярко-голубого цветов и множество видеороликов, сваленных в одну кучу. Если вы еще не сошли с ума, посетите их страницу на Facebook и посмотрите их видеоролики с ломаным английским и текстом, выскакивающим поверх видео.

2. Space is the Place

http://www.spaceistheplace.ca/

Первым делом вы увидите надоедливую GIFку, на которой каждую секунду взлетает космический корабль. На ослепительном ярко-синем фоне — текст небесно-голубого цвета. Чуть ниже — голова автора сайта, реющая в облаках. Сайт содержит разрозненную информацию о космических полетах и фотографии автора с ракетами и космонавтами.

Этот сайт не только неприятен для глаза, но и заинтересовать может разве что знакомых автора сайта и тех, кому нравятся люди среднего возраста, увлекающиеся космонавтикой.

3. Ling’s Cars

http://www.lingscars.com/

Сайт, посвященный продаже подержанных машин, весь наполнен сверкающими баннерами и стикерами всех цветов радуги, на нем сотни ссылок, которые ведут на такие же страницы со сверкающими баннерами. Везде, где возможно, вы увидите фотографии самого Лина (владельца сайта). Особенно доставляет изображение Лина с непрерывно трясущейся головой. Все самое худшее, что может быть в рекламе — на этом сайте.

4. ARNGREN

www.arngren.net

Это образец того, как не надо делать сайты, предназначенные для торговли. Огромный ассортимент товаров как будто свален в кучу на стартовой странице в совершенно беспорядочной последовательности. Найти интересующий товар очень тяжело. В левой части сайта есть меню, благодаря которому можно выбрать интересующий вид товара, но, пройдя по ссылке, вы увидите тот же хаотичный дизайн, а товары зачастую не соответствуют обозначенным категориям. Также на сайте нет никакой информации о владельцах сайта, о том, что они продают и почему у них стоит что-либо покупать.

5. Ronoslund

www.ronoslund.com

Личная страница Рона Ослунда, с космическим пейзажем и ужасным дизайном, на которой он рекламирует свой интернет-проект, вывешивает фотографии устаревших компьютеров и принцессы Дианы (с текстом поверх фотографий).

Рон Ослунд поднимает многозадачность и универсальность сайтов на новый уровень.

6. The World’s Worst Website Ever

www.theworldsworstwebsiteever.com

Этот сайт создан профессиональным вебдизайнером для того, чтобы собрать в одном месте типичные ошибки авторов сайтов и наглядно показать, как не надо делать сайты. Здесь можно прочитать полный список из 60 ошибок, которые намеренно допустил дизайнер. Впрочем, по сравнению с первой пятеркой, этот сайт получился довольно неплохим. Но автор сайта обещает в скором времени создать сайт с еще большим количеством ошибок.

7. Rent my Chest

www.rentmychest.com

Этот сайт серовато-коричневого цвета с беспорядочным набором слов задумывался как сайт-приманка с ключевыми словами, которым соответствуют ссылки на другие ресурсы. Владелец сайта предлагает разместить у себя ссылку на вашу страницу по приблизительной цене от 20 до 200 долларов в зависимости от дизайна ключевого слова (крупный или цветной шрифт обойдется недешево).

8. Neuticles
www.neuticles.com

Хотя дизайн этого сайта еще более-менее нормальный, его содержание поражает. Авторы проекта продают импланты половых органов для кастрированных домашних животных. С ними хозяева не будут комплексовать по поводу отсутствия яиц у своих питомцев, да и сами животные не будут так остро ощущать свою неполноценность.

Один имплант стоит 75 долларов — это намного дороже, чем стоимость операции по удалению настоящих половых органов.

Так что плохой дизайн сайта может не только снизить, но и даже повысить его посещаемость: люди со всего мира будут заходить на вашу страницу, чтобы посмеяться!

Российский военный корабль, иди нахуй!

Еще вам говорят, что “нелюбви к России братский украинский народ учат неонацисты и запад“. Вам будет интересно узнать, что этим неонацистам в Украине помогает Израиль, а ваши борцы с нацизмом бомбили Бабий Яр. В бригады территориальной обороны в дорогих ЖК украинских миллионников и в глухих селах идут практически все и военкоматы уже не справляются с очередями добровольцев. И когда наши дети боятся подходить к окну или плачут в бомбоубежищах, плачут одинаково на востоке или западе Украины, им все понятно без слов. Вы сами преподаете им урок русофобии, который они запомнят на всю жизнь.

Вы вероятно не до конца понимаете, зачем мы вам это рассказываем. Вы вне политики, не несете ответственности и ничего не можете сделать. Но проблема в том, что никто не вне политики, когда идет война. Когда ваши политики говорят, что готовы к санкциям и у них есть ядерный чемоданчик — есть одно «но». Они не спросили вас. И богаты не вы, а они. И бункер есть у них, а не у вас. При этом кольцо ограничений, включая возможности для побега из вашей страны, лично для вас драматически сжимается. Видели курс валют? А теперь попробуйте купить билет на самолет в Европу — получилось? Что по ценам на продукты? Вывести деньги из страны можете? От клиентов и партнёров на западе уже начали скрывать своё происхождение? Вам нормально? А помните, как вам хорошо жилось до этой полномасштабной войны, развязанной Россией против Украины? Это было в среду.

Вас ненавидит весь мир, и вы читаете это, пока стоите в очереди в банкомат. Не снимайте всё — вам надо откладывать на репарации жертвам российской «мирной операции» в Украине. Чек растёт с каждым днём и ляжет на вас и ваших детей, спросите Германию, как это работает — вам расскажут.
А мы никогда вас не простим, если вы ничего не сделаете. 15 наших детей уже родились в бомбоубежищах! Написать #нетвойне — мало. Просить прекратить войну — поздно. Невозможно смягчить удар, когда он ракетный. Поверьте, нам не нужна ваша помощь — просто идите на хуй и никогда не смотрите в сторону Украины. Вы себе помогите. А мы сплотились, как никогда. И весь мир за нас.

Редакция AIN.UA

женщины глазами статистики — Официальный сайт Губкинского городского округа

Международный женский день отпраздновали 78 620 500 сильных и независимых женщин России. Медиаофис Всероссийской переписи населения 2020 года подготовил отчет о жизни российских женщин: чем живут, как зарабатывают и развлекаются в свободное время.

 

Относительно недавно, в 1903 году, вид работающих женщин вызывал в лучшем случае недоумение. Полная сочувствия заметка, посвященная начинающим труженицам, была опубликована в журнале «Звезда»: «И женщины, вышедшие из теремов, стараются работать, кто и как может… Эти удары судьбы можно охарактеризовать двумя словами: надо работать».

Но женщины в погоне за равноправием стремительно атаковали рынок труда. Если в 1915 году их допускали только на некоторые должности, например, почтальонов и воспитательниц детских садов, то сегодня они летают в космос и признаны полноценными единицами российской боевой авиации.

Современная российская женщина может позволить себе работать почти где и кем угодно. Согласно данным статистического сборника Росстата «Женщины и мужчины России, 2018» почти 65% женщин в возрасте от 15 до 72 лет в полной мере пользуются этим правом, активно конкурируя с сильным полом даже в самых сложных профессиях, требующих высокой квалификации. Доля работающих женщин с высшим образованием достигает 56%.

Работают наши женщины во всех областях экономики, от добычи полезных ископаемых до государственного управления и обеспечения военной безопасности. Но большинство заняты в сферах торговли, образования, здравоохранения и оказания социальных услуг.

Женщины в России больше мужчин удовлетворены выполняемыми обязанностями, режимом работы, условиями труда, расстоянием до работы и получают больше профессионального и морального удовлетворения от своей деятельности. Единственное, что не устраивает почти всех занятых в экономике женщин — это заработок. Не вполне удовлетворены 52% работниц и совсем не удовлетворены — 13,5%.

Во всех областях экономики средняя заработная плата у женщин меньше, чем у мужчин, и это не зависит от занимаемой должности. В среднем по рынку труда зарплата женщины руководителя, специалиста, служащего или рабочего меньше, чем у мужчины на сходной позиции. Например, позиция среднего специального персонала в области правовой, социальной работы, культуры и родственных занятий имеет расхождение по заработной плате в пять раз. Исключение составляют женщины — квалифицированные работники сельского и лесного хозяйства, рыбоводства и рыболовства и неквалифицированные работники по сбору мусора до 45 лет. Их зарплата, как ни странно, выше, чем у мужчин.

Согласно данным Всероссийской переписи населения 2010 года, более 65% работающих женщин состоят в официальном или незарегистрированном браке. Около 80% имеют детей в возрасте до 18 лет, в том числе дошкольного возраста — 66%. Но, даже имея ребенка в возрасте до 3 лет, половина россиянок продолжают работать.

В целом 86% женщин и мужчин тратят на работу около 40 часов в неделю. Однако, как показывает статистика, занятые россиянки, по сравнению с мужчинами, имеют меньше свободного времени на себя и в два раза больше времени тратят на ведение домашнего хозяйства в любой день недели. Больше всего времени занимает уборка, стирка, глажка и приготовление пищи. Например, в выходные у женщин на стирку и глажку уходит в среднем полчаса, в то время как у мужчин — две минуты.

Но отдавая много времени и сил своим родным и близким, наши женщины активно организуют и свой отдых. Чуть более 42% из них предпочитают кафе и рестораны, 35,6% — походы в кино, 30,7% — духовное общение с людьми одной веры. Не реже раза в год посещают концерты 30% российских женщин, театр — 22,5%, художественные выставки или музеи — 17%. Интересно, что среди мужчин не менее раза в год в театр приходит лишь 11,9%, что практически вдвое меньше, чем среди женщин. Проще всего мужчинам и женщинам найти друг друга в кинотеатрах и кафе, куда они ходят с примерно равной интенсивностью.

На основе результатов Всероссийской цифровой переписи населения 2020 года будет сформирован очередной сборник «Женщины и мужчины России». Участвуя в переписи, каждый житель государства вносит свой вклад в будущее страны. За сухими статистическими данными стоят живые люди — Я/Мы соотечественники. Вместе мы создаем будущее!

 

Всероссийская перепись населения пройдет с 1 по 31 октября 2020 года с применением цифровых технологий. Главным нововведением предстоящей переписи станет возможность самостоятельного заполнения жителями России электронного переписного листа на портале «Госуслуги» (Gosuslugi.ru). При обходе жилых помещений переписчики Росстата будут использовать планшеты со специальным программным обеспечением. Также переписаться можно будет на переписных участках, в том числе в помещениях многофункциональных центров оказания государственных и муниципальных услуг (МФЦ).

 

Медиаофис ВПН-2020
[email protected]
www.strana2020.ru
+7 (495) 933-31-94

Сообщества ВПН-2020 в социальных сетях:
https://www.facebook.com/strana2020
https://vk.com/strana2020
https://ok.ru/strana2020
https://www.instagram.com/strana2020
youtube.com

Как выявить потенциально слабые стороны прибора?

REDMOND LABoratorium. Технологии как они есть!

Специалисты лаборатории REDMOND тестируют новую технику в обычных и стрессовых условиях эксплуатации, проверяя все характеристики устройства: потребляемую мощность, корректную работу всех функций, надежность конструкции прибора. Одна из важнейших задач бренда REDMOND – предоставить пользователям технику, которая будет работать исправно независимо от того, как часто и интенсивно она используются. И если в ходе тестирования выявляются какие-либо погрешности, которые можно улучшить для последующий более удобной эксплуатации, устройство отправляется на доработку.

Прототипы и предсерийные образцы кухонных устройств – мультиварок, грилей, духовых шкафов, миксеров и других – после успешного инженерного тестирования отправляются в отдел экспериментальной кулинарии. Там повара испытывают прибор в деле: готовят блюда на всех программах и проверяют даже то, насколько удобно чистить устройство после приготовления.

На первом этапе тестирования работа встроенных весов проверялась на чайниках из ассортимента бренда: все дополнительные комплектующие в них монтировали вручную. Но для заключительного тестирования необходимо создать предсерийный образец, который позволит максимально точно оценить работу нового чайника именно в таком виде, в каком он будет представлен пользователям. Функционал SkyKettle RK-G220S уникален – возможность определения количества налитой воды и умная RGB-подсветка нового поколения не представлены ни в одном чайнике. В ходе тестирования было решено разработать и сконструировать корпус для прибора с нуля, поскольку ни один из чайников не подходит для установки и весов, и системы RGB-подсветки.

Сейчас REDMOND готовит к выпуску новинку – умный аэрогриль. На начальном этапе тестирования специалисты отдела качества проверили технические характеристики прибора и убедились, что все фактические параметры и функции тестового образца совпадают с заявленными в техническом задании. Эта работа в обязательном порядке проводится с каждым прибором для того, чтобы пользователь получил инструкцию с максимально точной информацией об устройстве. Протестировав базовые характеристики аэрогриля: напряжение и мощность, тип управления, работу таймера, защиты от перегрева и другие, инженеры переходят к тестированию механических деталей прибора.

Чтобы выявить потенциально слабые стороны устройства, которые могут проявить себя спустя некоторое время использования, специалисты лаборатории проработали несколько тестов. Например, чтобы проверить надежность сенсорных кнопок, каждую из них нажимают не одну сотню раз. А тест на оценку стойкости краски позволяет заключить, что все значки и надписи на панели управления прибора не сотрутся со временем, и пользователю не придется открывать инструкцию, чтобы правильно установить настройки приготовления.


Также при тестировании важно проверить, насколько указанные на регуляторе режимы нагрева соответствуют фактической температуре внутри рабочей камеры аэрогриля. Ведь хороший результат в приготовлении практически любого блюда напрямую зависит от точности установленной температуры.

Для следующего этапа проверки умный аэрогриль был передан в отдел экспериментальной кулинарии. На первом этапе кулинарного тестирования повара готовили несколько разных блюд. Рабочие тесты прошли успешно и показали, что блюда в аэрогриле пропекаются как планировалось – равномерно и внутри, и снаружи, готовятся быстро. На приготовление мясных котлет и курицы ушло 15 минут, бисквиты в силиконовых формах были полностью готовы спустя 30 минут. Блюда готовились без использования масла, при этом продукты не пригорели и не прилипли ни к решетке, ни к специальным формам.

Дополнительно повара дают рекомендации по корректировке логики работы приборов. В первоначальном техническом задании для аэрогриля была указана следующая последовательность установки рабочих параметров: сначала выбрать температуру, а когда прозвучит сигнал о достижении заданного параметра, установить время приготовления. Ответственные за испытания аэрогриля повара предложили усовершенствовать этот механизм: теперь в итоговом приборе возможна одновременная установка времени и температуры, и пользоваться аэрогрилем будет намного удобнее.

После тестов предсерийного образца отчет с комментариями специалистов отделов качества и экспериментальной кулинарии отправляется в отдел R&D. Инженеры и разработчики продолжат работу над прибором, и когда будет готов финальный образец, устройство снова отправится в отдел экспериментальной кулинарии. Повара приступят к созданию и тестированию рецептов для кулинарной книги, которая будет доступна не только в печатном виде, но и в мобильном приложении. После чего для умного аэрогриля будет разработан пользовательский интерфейс для удобного управления прибором со смартфона.

Умный аэрогриль REDMOND планируется вывести в серийное производство в скором времени, и в ближайшее время он выйдет в продажу.

Статьи по теме

Как выявить потенциально слабые стороны прибора?

Зачем мы печатаем чайник на 3D-принтере?

Что можно сделать в мультиварке без мультиварки?

Какую часть тестирования доверить роботу?

Сила ветра. Шкала Бофорта

Сила ветра у земной поверхности по шкале Бофорта
(на стандартной высоте 10 м над открытой ровной поверхностью)

Баллы Бофорта Словесное определение силы ветра Скорость ветра, м/сек Действие ветра
на суше на море
0 Штиль 0-0,2 Штиль. Дым поднимается вертикально Зеркально гладкое море
1 Тихий 0,3-1,5 Направление ветра заметно по относу дыма, но не по флюгеру Рябь, пены на гребнях нет
2 Лёгкий 1,6-3,3 Движение ветра ощущается лицом, шелестят листья, приводится в движение флюгер Короткие волны, гребни не опрокидываются и кажутся стекловидными
3 Слабый 3,4-5,4 Листья и тонкие ветви деревьев всё время колышутся, ветер развевает верхние флаги Короткие, хорошо выраженные волны. Гребни, опрокидываясь, образуют стекловидную пену, изредка образуются маленькие белые барашки
4 Умеренный 5,5-7,9 Ветер поднимает пыль и бумажки, приводит в движение тонкие ветви деревьев Волны удлинённые, белые барашки видны во многих местах
5 Свежий 8,0-10,7 Качаются тонкие стволы деревьев, на воде появляются волны с гребнями Хорошо развитые в длину, но не очень крупные волны, повсюду видны белые барашки (в отдельных случаях образуются брызги)
6 Сильный 10,8-13,8 Качаются толстые сучья деревьев, гудят телеграфные провода Начинают образовываться крупные волны. Белые пенистые гребни занимают значительные площади (вероятны брызги)
7 Крепкий 13,9-17,1 Качаются стволы деревьев, идти против ветра трудно Волны громоздятся, гребни срываются, пена ложится полосами по ветру
8 Очень крепкий 17,2-20,7 Ветер ломает сучья деревьев, идти против ветра очень трудно Умеренно высокие длинные волны. По краям гребней начинают взлетать брызги. Полосы пены ложатся рядами по направлению ветра
9 Шторм 20,8-24,4 Небольшие повреждения; ветер срывает дымовые колпаки и черепицу Высокие волны. Пена широкими плотными полосами ложится по ветру. Гребни волн начинают опрокидываться и рассыпаться в брызги, которые ухудшают видимость
10 Сильный шторм 24,5-28,4 Значительные разрушения строений, деревья вырываются с корнем. На суше бывает редко Очень высокие волны с длинными загибающимися вниз гребнями. Образующаяся пена выдувается ветром большими хлопьями в виде густых белых полос. Поверхность моря белая от пены. Сильный грохот волн подобен ударам. Видимость плохая
11 Жестокий шторм 28,5-32,6 Большие разрушения на значительном пространстве. На суше наблюдается очень редко Исключительно высокие волны. Суда небольшого и среднего размера временами скрываются из вида. Море всё покрыто длинными белыми хлопьями пены, располагающимися по ветру. Края волн повсюду сдуваются в пену. Видимость плохая
12 Ураган 32,7 и более   Воздух наполнен пеной и брызгами. Море всё покрыто полосами пены. Очень плохая видимость

Иммонен: «Медвешчак» не слабый, как многие думают » Торпедо Нижний Новгород

– Яркко, непривычно видеть вас не в форме «Ак Барса». Сами уже привыкли к новой обстановке?

— Да, привыкаю. Это, кстати, даётся мне очень легко. В команде много хороших ребят, многие говорят по-английски. Мне легко вписаться в команду.

– У вас было желание остаться в Казани?

— Я сам точно не знаю, что произошло в Казани. Просто так решили. Я уже не думаю об этом, просто счастлив, что теперь в Нижнем Новгороде.

— Другие варианты были?

— Да, но я хотел остаться в КХЛ и играть в «Торпедо».

– «Ак Барс» покинули Морозов, Зарипов, Капанен, вы. Теперь это уже другой «Ак Барс»?

— Да, абсолютно. Посмотрим, как мы с ними сыграем. Хотя сейчас об этом рано думать, ещё надо много работать, найти сыгранность. 

— С Капаненом общаетесь?

— Да, мы же друзья. Часто общаемся. Он уже устроился в новой команде, в Праге. Вчера неплохо сыграл.

– «Торпедо» перевели на Восток. Там пробиться в плей-офф сложнее, чем на Западе?

— Не думаю. Если будем хорошо играть, побеждать, то всё получится. Главное сейчас – найти свою игру. 

– В команде много новичков, новый главный тренер. Сколько времени займёт привыкание друг к другу?

— Какое-то время точно, сразу команда не строится. У нас новый тренер, новые игроки, новая система игры. Сейчас мы её выстраиваем. Сейчас наша игра неидеальна, но до начала сезона ещё достаточно времени, чтобы привести её в порядок. К началу сезона будем готовы.

— Ваш партнёр по команде Тим Брент говорил, что тренировочный сбор в Братиславе был сложнейшим в его жизни. Для вас так же?

— Ну, я бы не сказал, что сложнейшим, но явно непростым. Три тренировки в день. Главное, что от этих тренировок будет польза. Позже мы будем лишь рады, что так хорошо поработали. 

– В КХЛ вступили «Медвешчак» и «Адмирал». Как вам такое пополнение лиги?

— От этого чемпионат станет лишь интереснее, всегда новички добавляют что-то своё в лигу. Правда, во Владивосток летать далековато будет. Ну что поделаешь. Зато будет интереснее и болельщикам, и игрокам.

— У вас не вызывает иронии выражение «хорватский хоккей»?

— Ну, мы играли с хорватами на сборе в Словакии. У них хорошая команда, они не слабые, как некоторые думают! К тому же там много канадцев в составе.

– В следующем сезоне в КХЛ будет «Йокерит». Как вам такая перспектива?

— Я был немного удивлён, когда это произошло. Думаю, что это хорошо. Новая команда будет играть в КХЛ, не вижу ничего плохого в этом. Это, опять же, сделает чемпионат интереснее.

— Болельщики из Финляндии пойдут на КХЛ?

— Думаю, что должны. Хотя сложно сказать. Они привыкли к финской лиге. Но я верю, что они пойдут и на матчи КХЛ.

— А финские игроки захотят играть в этом клубе?

— Почему нет? Многие финны хотят играть в КХЛ, а теперь им даже не надо уезжать из Финляндии. А уровень КХЛ очень хороший. 

– С Эрккой Вестерлундом, главным тренером сборной Финляндии на Олимпиаде, общались летом?

— Да, мы с ним разговаривали. У нас должен был быть сбор, но его отменили.

— Почему?

— У многих игроков были травмы, кто-то не восстановился после сезона. Поэтому решили обойтись без тренировочного сбора, тем более что впереди у сборной будут Евротуры. 

— Поедете на первый этап?

— Нет. Мы поговорили с Вестерлундом и решили, что мне будет лучше остаться с новой командой, чтобы не оставлять «Торпедо». Всё-таки тут всё новое, и полезнее будет потренироваться с командой, подготовиться к сезону. 

– Юкка Ялонен всегда приглашал вас в сборную. Почему вы не участвовали в чемпионате мира?

— Приглашение было, но я не смог поехать из-за микротравм. Мне хотелось залечить их, сохранить хорошую форму и быть готовым к сезону. Мы обсудили ситуацию с Ялоненом и решили, что так будет лучше. 

— В Нижнем уже устроились?

— В процессе. Я всего неделю здесь, и каждый день у нас матчи. Город кажется довольно симпатичным. Приехала моя семья, будем обустраиваться. Они уже привыкли к переездам.

— И маленький ребёнок?

— Да, ему всего год. Поэтому переезжать просто, в школу не ходит ещё.

16-08-2013, 11:18

Нашли опечатку? Выделите ее и нажмите Ctrl+Enter

Сайт администрации МР «Удорский» — ЭТОТ СИЛЬНЫЙ СЛАБЫЙ ПОЛ: ЖЕНЩИНЫ ГЛАЗАМИ СТАТИСТИКИ

Международный женский день 8 марта отпразднуют 78,6 миллиона женщин России. В Республике Коми — 438 тысяч (53% в общей численности населения региона). Данные Всероссийских переписей населения и обследований населения расскажут о том, чем живут, как зарабатывают и проводят свое свободное время представительницы слабого пола.
Относительно недавно, в 1903 году, вид работающих женщин вызывал в лучшем случае недоумение. Полная сочувствия заметка, посвященная начинающим труженицам, была опубликована в журнале «Звезда»: «И женщины, вышедшие из теремов, стараются работать, кто и как может… Эти удары судьбы можно охарактеризовать двумя словами: надо работать».
Но женщины в погоне за равноправием стремительно атаковали рынок труда. Если в 1915 году их допускали только на некоторые должности, например, почтальонов и воспитательниц детских садов, то сегодня они летают в космос и признаны полноценными единицами российской боевой авиации.
Современная российская женщина может позволить себе работать почти где и кем угодно. Согласно данным статистического сборника Росстата «Женщины и мужчины России, 2018» почти 65% женщин в возрасте от 15 до 72 лет в полной мере пользуются этим правом, активно конкурируя с сильным полом даже в самых сложных профессиях, требующих высокой квалификации. Доля работающих женщин с высшим образованием достигает 56%.
Работают наши женщины во всех областях экономики, от добычи полезных ископаемых до государственного управления и обеспечения военной безопасности. Но большинство заняты в сферах торговли, образования, здравоохранения и оказания социальных услуг.
Женщины в России больше мужчин удовлетворены выполняемыми обязанностями, режимом работы, условиями труда, расстоянием до работы и получают больше профессионального и морального удовлетворения от своей деятельности. Единственное, что не устраивает почти всех занятых в экономике женщин — это заработок. Не вполне удовлетворены 52% работниц и совсем не удовлетворены — 14%.
Во всех областях экономики средняя заработная плата у женщин меньше, чем у мужчин, и это не зависит от занимаемой должности. В среднем по рынку труда зарплата женщины руководителя, специалиста, служащего или рабочего меньше, чем у мужчины на сходной позиции.
Согласно данным Всероссийской переписи населения 2010 года, более 65% работающих женщин состоят в официальном или незарегистрированном браке. Около 80% имеют детей в возрасте до 18 лет, в том числе дошкольного возраста — 66%. Но, даже имея ребенка в возрасте до 3 лет, половина россиянок продолжают работать.
В целом 86% женщин и мужчин тратят на работу около 40 часов в неделю. Однако, как показывает статистика, занятые россиянки, по сравнению с мужчинами, имеют меньше свободного времени на себя и в два раза больше времени тратят на ведение домашнего хозяйства в любой день недели. Больше всего времени занимает уборка, стирка, глажка и приготовление пищи. Например, в выходные у женщин на стирку и глажку уходит в среднем полчаса, в то время как у мужчин — две минуты.
Но отдавая много времени и сил своим родным и близким, наши женщины активно организуют свой отдых. Чуть более 42% из них повещают кафе и рестораны, 36% — походы в кино, 31% — духовное общение с людьми одной веры. Не реже раза в год посещают концерты 30% российских женщин, театр — 23%, художественные выставки или музеи — 17%. Интересно, что среди мужчин не менее раза в год в театр приходит лишь 12%, что практически вдвое меньше, чем среди женщин. Проще всего мужчинам и женщинам найти друг друга в кинотеатрах и кафе, куда они ходят с примерно равной интенсивностью.
На основе результатов Всероссийской цифровой переписи населения 2020 года будет сформирован очередной сборник «Женщины и мужчины России». Участвуя в переписи, каждый житель государства вносит свой вклад в будущее страны. За сухими статистическими данными стоят живые люди. Вместе мы создаем будущее!

Всероссийская перепись населения пройдет с 1 по 31 октября 2020 года с применением цифровых технологий. Главным нововведением предстоящей переписи станет возможность самостоятельного заполнения жителями России электронного переписного листа на портале «Госуслуги» (Gosuslugi.ru). При обходе жилых помещений часть переписчиков Росстата будут использовать планшеты со специальным программным обеспечением. Также переписаться можно будет на стационарных переписных участках.

 

Ваш сайт слабый. Используйте эти 5 методов, чтобы сделать его пуленепробиваемым

Автор Стефани Барнс

SEO, Цифровой маркетинг | 2 минуты чтения

Если вы хотите получать высокие рейтинги в поиске, привлекающие множество уникальных посетителей, вам понадобится сильный и надежный сайт.Вот 5 основных принципов, которые вы должны учитывать. Начните сегодня и зарядите свой сайт порцией адреналина.

Как усилить свой сайт и обойти конкурентов

Важно, чтобы вы регулярно уделяли время своему веб-сайту, чтобы повысить его эффективность. Интернет-конкуренция постоянно растет, и если вы хотите конкурировать со своими конкурентами, вам нужно поддерживать свой сайт в хорошем состоянии.

Вот как вы можете улучшить силу своего веб-сайта и сделать свой онлайн-бизнес похожим на супергероя.

Увеличьте размер вашего сайта

Чем больше сайт, тем больше у вас будет сил. Поскольку конкуренция в Интернете очень жесткая, ваш сайт будет бороться за власть, если на нем будет всего несколько страниц контента. Посмотрите на некоторые крупные компании в Интернете, у них есть сотни страниц.

Не то чтобы я рекомендовал вам бежать и писать сотни страниц. Вам необходимо создать страницы с релевантным содержанием  , относящимся к вашим услугам и отрасли.Вот почему блог является полезным инструментом, вы можете делиться полезными советами и отраслевыми новостями со своими читателями и, естественно, добавлять новые страницы на свой сайт.

Увеличьте авторитет домена

Требуется время, чтобы ваше доменное имя повысило свой авторитет, но вы можете сделать работу сегодня, которая позволит вам пожинать плоды позже. Вот несколько способов увеличить свой DA:

  • Создавайте контент, на который люди будут ссылаться. Ссылки с сайтов с более высоким авторитетом домена — это мега плюс для вас и придаст вам дополнительную силу.
  • Убедитесь, что ваша базовая поисковая оптимизация завершена.  Оптимизация страниц помогает поисковым системам легче сканировать ваш сайт и может увеличить трафик.
  • Удаление сомнительных обратных ссылок. Наличие спам-ссылок на ваш сайт отрицательно скажется на авторитете вашего домена.

Избавьтесь от спам-ссылок

Очистите свой ссылочный профиль. Со временем все больше спам-ссылок будут ссылаться и снижать силу вашего сайта. Google не любит сайты, к которым прикреплено множество неверных ссылок.

Проверьте свой профиль и отклоните любые спам-ссылки, после чего суперспособности вашего сайта могут быть восстановлены.

Убедитесь, что ваш сайт оптимизирован для мобильных устройств

Поскольку Google объявил, что все веб-сайты должны быть оптимизированы для мобильных устройств, это НЕОБХОДИМО, если вы хотите иметь надежный веб-сайт. Поскольку все больше людей используют свои телефоны для поиска в Интернете, Google решил, что все сайты должны быть оптимизированы для мобильных устройств, и те, кто игнорирует Google, получат хит в результатах поиска.

Получить сертификат SSL

SSL (Secure Sockets Layer) – это цифровая форма дополнительной защиты вашего веб-сайта, которая обеспечивает безопасность в вашей компьютерной сети.Считается, что наличие SSL-сертификата также помогает повысить рейтинг SEO, но, безусловно, помогает обеспечить безопасность вашего сайта и ваших посетителей в Интернете.

Хотите узнать, насколько силен ваш веб-сайт? Воспользуйтесь этим БЕСПЛАТНЫМ оценщиком веб-сайтов и узнайте, что нужно исправить:

.

Как вы поддерживаете высокий уровень заряда вашего сайта в течение длительного времени?

В долгосрочной перспективе, чтобы ваш веб-сайт оставался сильным, стоит подумать об инвестициях в SEO. Благодаря поисковой оптимизации ваш веб-сайт можно регулярно обновлять и укреплять, чтобы он оставался в хорошей форме.

Когда вы знаете, что ваши конкуренты работают над улучшением своего присутствия в Интернете, а Google регулярно объявляет о новых обновлениях, вы должны быть готовы адаптироваться и тратить время на обновление и работу над своим сайтом. Если ваш веб-сайт станет слабее, вам будет трудно дать отпор конкурентам, и они будут красть ваших клиентов.


Знаете ли вы другие способы повысить надежность веб-сайта? Поделитесь своим советом в комментариях ниже.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Слабая стабильность спаривания семян и большое количество сайтов-мишеней снижают эффективность lsy-6 и других микроРНК менее искусный.Здесь мы показываем, что низкая эффективность

lsy-6 может быть воспроизведена в клетках HeLa и что miR-23 (миРНК млекопитающих) также имеет низкую эффективность в этих клетках. Репортерные результаты и данные массива указывают на два свойства этих miRNAs, которые придают низкую эффективность: их слабая предсказанная стабильность спаривания семян (SPS) и их высокая численность сайта-мишени (TA). Эти два свойства также объясняют дифференциальную склонность малых интерферирующих РНК (siRNAs) к репрессии непреднамеренных мишеней. Используя эти идеи, мы расширяем инструмент TargetScan для количественного прогнозирования регуляции миРНК (и отклонения миРНК), чтобы моделировать дифференциальные способности миРНК (миРНК), тем самым повышая эффективность прогнозирования.Более того, мы предполагаем, что siRNAs, предназначенные для того, чтобы иметь как более слабый SPS, так и более высокую TA, будут иметь меньше нецелевых клеток без нарушения целевой активности.

Введение

МикроРНК представляют собой ~22-нуклеотидные РНК, которые соединяются с сообщениями генов, кодирующих белок, для прямой посттранскрипционной репрессии этих мРНК-мишеней 1,2 . Многочисленные исследования на животных с использованием широкого спектра методов, включая сравнительный анализ последовательностей, сайт-направленный мутагенез, генетику, профилирование мРНК, коиммунопреципитацию и протеомику, неоднократно показывали, что идеальное спаривание с нуклеотидами микроРНК 2–7, известное как miRNA seed важен для распознавания многих, если не большинства miRNA-мишеней -3- .Чтобы обеспечить более чем маргинальную репрессию мишеней у млекопитающих, это спаривание семян обычно дополняется либо совпадением с нуклеотидом 8 микроРНК (сайт 7mer-m8) 4–7 , либо А напротив нуклеотида 1 (сайт 7mer-A1) 4 ,7 или обоими (сайт 8mer) 4,7 . В относительно редких случаях нацеливание также происходит через 3′-компенсаторные сайты 4,5,8 и центральные сайты 9, для которых существенное спаривание за пределами семенной области компенсирует несовершенное семенное спаривание.

Одна микроРНК может нацеливаться на сотни различных мРНК через совпадающие сайты 10 . В самом деле, большинство мРНК человека являются консервативными регуляторными мишенями 8 , и многие дополнительные регуляторные взаимодействия происходят через неконсервативные сайты 11-13 . Однако не каждый сайт эффективен; Сайты с 8 нуклеотидами чаще эффективны, чем сайты с 7 нуклеотидами, которые чаще эффективны, чем сайты с 6 нуклеотидами 7,14 . Еще одним фактором является контекст сайта. Например, сайты в 3’UTRs более эффективны, чем сайты на пути рибосомы 7 .Среди сайтов 3’UTR те, которые находятся вдали от центров длинных UTR, и те, которые находятся в высоком локальном контексте последовательности AU, чаще эффективны 7 , что согласуется с сообщениями о том, что сайты, которые, по прогнозам, находятся в более доступной вторичной структуре, имеют тенденцию быть более эффективными. 15–19 . На эффективность сайта также влияет близость к другим сайтам связывания микроРНК 7,20 , сайтам связывания белков 21 и последовательностям, которые могут соединяться с 3′-областью микроРНК, особенно нуклеотидам 13–17 (ссылка ). 7 ).

Исследования эффективности сайтов были сосредоточены в первую очередь на разных сайтах одной и той же микроРНК, без систематического изучения того, могут ли некоторые последовательности микроРНК быть по своей природе более эффективными в нацеливании, чем другие. Широко консервативные miRNAs обычно имеют намного больше консервативных взаимодействий нацеливания, чем другие miRNAs 4,8 , и высоко или широко экспрессируемые miRNAs, по-видимому, нацелены на большее количество мРНК, чем другие 22 , но эти явления отражают эволюционную случайность больше, чем присущую способность нацеливания.

Наш интерес к нацеливанию на компетентность был вызван интригующими результатами, касающимися lsy-6 miRNA. При тестировании на C. elegans только одна из 14 предсказанных мишеней с 7–8-нуклеотидными сайтами, совпадающими с семенами, отвечает на lsy-6 , что было интерпретировано как демонстрация того, что идеальное спаривание семян не является в целом надежным предиктором для взаимодействия миРНК-мишень 23 . Альтернативная интерпретация, которая казалась более скупой по сравнению с результатами для многих других микроРНК в других контекстах 3 , заключается в том, что результаты для lsy-6 могут быть неприменимы к другим миРНК, поскольку lsy-6 могут иметь необычно высокую направленность. специфичность из-за необычайно низкого мастерства таргетинга.Аналогичное обоснование может объяснить результаты для miR-23 млекопитающих, др. miRNA, которая дает необычно слабые ответы от большинства репортеров, предназначенных для тестирования предсказанных мишеней.

При рассмотрении свойств, которые могут приводить к низкому уровню нацеливания, мы отметили, что как lsy-6, так и , и miR-23 имеют необычно богатые AU затравочные области, что может снизить стабильность взаимодействий при спаривании зародышей. Возможно, необходим порог стабильности спаривания семян (SPS), чтобы miRNA оставалась ассоциированной с мишенями достаточно долго, чтобы достичь широко распространенного таргетинга на основе семян.В самом деле, предсказанный SPS коррелирует со склонностью siRNAs репрессировать непреднамеренные мишени , 24, , процесс, называемый «off-targeting», который происходит посредством того же основанного на семенах распознавания, что и для эндогенных miRNA, нацеленных на -10, . Однако эта интерпретация потенциально сбивает с толку то, что микроРНК с богатыми AU начальными областями имеют больше сайтов связывания 3’UTR, что является следствием богатого AU нуклеотидного состава 3’UTR, что может ослабить эффект на каждое сообщение-мишень. В самом деле, обилием мест-мишеней (ТА) можно управлять, чтобы отобрать микроРНК от их нормальных мишеней 25,26 , и предполагается, что естественная ТА играет роль в нацеливании микроРНК и ненаправлении миРНК 27,28 , хотя эти зарегистрированные эффекты ТА не были полностью отделены от потенциальных эффектов СФС.Здесь мы обнаруживаем, что как SPS, так и TA оказывают существенное влияние на умение нацеливаться, а затем применяем эти идеи для улучшения прогнозов целей miRNA.

Результаты

Специфичность нацеливания

lsy-6 воспроизведена в клетках HeLa

Нацеливание Lsy-6 было первоначально исследовано на нейроне C. elegans , тогда как более эффективное нацеливание было экспериментально подтверждено другими микроРНК. в других системах, иногда в тканях или первичных клетках позвоночных 11,13,29,30 но чаще в клеточных линиях 3 .Чтобы проверить, могут ли различия в способности нацеливания быть связаны с очень разными биологическими контекстами, в которых исследовались миРНК, мы перенесли 14 3’UTR, протестированных в C. elegans , в репортерную систему люциферазы, обычно используемую в клеточных линиях млекопитающих, и ввели lsy-6 miRNA путем совместной трансфекции несовершенного дуплекса РНК, представляющего последовательности miRNA и miRNA * (дополнительная рис. 1a). Как и у червей, только cog-1 3’UTR реагировали в клетках HeLa (4).Репрессия была потеряна, когда контрольная миРНК (миР-1) заменила lsy-6 или когда два сайта cog-1 были мутированы, что привело либо к несовпадениям (), либо к колебаниям G:U (дополнительная рис. 1b, c)

Увеличение SPS при снижении TA придавало типичную способность нацеливания lsy-6 и miR-23 miRNAs. ( a ) Последовательности микроРНК и сайты-мишени протестированы в репортерных анализах на этой фигуре. Каждая микроРНК была котрансфицирована репортерными плазмидами в виде дуплекса, предназначенного для представления микроРНК в паре с ее цепью микроРНК * (дополнительная рис. 1a).( b ) Реакция репортеров с 3’UTR предсказанных мишеней lsy-6 после котрансфекции с lsy-6 . В качестве контроля специфичности эксперимент также проводили с использованием неродственной миРНК, миР-1 (серые столбцы). Геометрические средние нанесены относительно средних значений репортеров, в которых предсказанные сайты-мишени были мутированы после нормализации репрессии, наблюдаемой для миР-1 (серые столбцы). Мутантные сайты этого эксперимента были родственными сайтами . Столбики погрешностей представляют собой третье по величине и третье по величине значение среди 12 повторов из 4 независимых экспериментов.Указаны статистически значимые различия в репрессии родственной микроРНК по сравнению с репрессией неродственной микроРНК. (*p <0,01, **p <0,001, критерий суммы рангов Уилкоксона). ( c ) Распределение предсказанных SPS для сайтов 7mer-m8 60 консервативных семейств микроРНК нематод 36 (дополнительная таблица 7). Значения округлялись в меньшую сторону до следующей полуцелой единицы. (d) Распределение SPS для сайтов 7mer-m8 87 консервативных семейств микроРНК позвоночных 8 (дополнительная таблица 7).( e ) Распределение предсказанного геномного ТА для сайтов 3’UTR 7mer-m8 60 консервативных семейств микроРНК нематод (дополнительная таблица 7). Значения были округлены до следующей десятой доли единицы. ( f ) Распределение предсказанного геномного ТА для сайтов 3’UTR 7mer-m8 87 консервативных семейств микроРНК позвоночных (дополнительная таблица 7). ( g ) Реакция репортеров мутировала таким образом, что их сайты совпадали с посевной миР-142. Родственной микроРНК была химера miR-142 lsy-6 ; неродственные сайты составили lsy-6 сайтов.В противном случае, как в b . (h ) То же, что и g , за исключением демонстрации реакции на трансфекцию miR-142. ( i ) Ответ репортеров с 3’UTR предсказанных мишеней миР-23 после котрансфекции миР-23a. Неродственные сайты были для miR-CGCG. В противном случае, как в b . ( j ) Реакция репортеров мутировала таким образом, что их сайты совпадали с посевным материалом miR-CGCG, ко-трансфицированным как родственная miRNA. Неродственные сайты были для миР-23.В противном случае, как в i .

Каждый из 14 3’UTR имел по крайней мере один канонический 7–8-нуклеотидный сайт lsy-6 , а 11 UTR имели сайт, консервативный в трех секвенированных нематодах (дополнительная таблица 1). При оценке с использованием модели контекстной оценки некоторые сайты имели оценки, сопоставимые с оценками сайтов, которые опосредуют репрессию в этом анализе 7 (дополнительная таблица 1). Более того, 3’UTR C27H6.9 имел два 8-мерных сайта с оценками, соответствующими таковым для двух сайтов cog-1 .Близкое совпадение между результатами нашего гетерологичного репортерного анализа и предыдущими результатами на нейронах C. elegans показало, что исключительная специфичность для нацеливания на cog-1 3’UTR не требует эндогенного клеточного контекста lsy-6 . репрессии; он работал в культуре клеток HeLa и, таким образом, объяснялся внутренними свойствами lsy-6 и его мишеней. Этот объединяющий результат также подразумевает, что эти свойства можно исследовать в культуре клеток млекопитающих, что проще, чем использование стабильных репортерных линий у червей.

Увеличение SPS при снижении TA повышает эффективность нацеливания

Как и ожидалось, для миРНК с последовательностью UUUGUAU в нуклеотидах 2–8 расчетная свободная энергия (Δ G °) предсказанного SPS для lsy-6 8mer или Сайты 7mer-m8 (обе семь пар оснований) составляли -3,65 ккал моль 90 115 -1 90 116 , что было слабее, чем у всех, кроме одной консервативной микроРНК нематоды (). Предсказанный SPS lsy-6 был также слабее, чем у самой слабой из 87 широко консервативных miRNAs позвоночных (14).Предсказанная Δ G ° 8-мерного или 7мер-m8 совпадения семян для miR-23 составила -5,85 ккал моль -1 , что попало в нижний квинтиль для широко консервативных miRNAs позвоночных (). Аналогичные результаты наблюдаются для сайтов 7mer-A1 или 6mer (оба по 6 пар оснований) для обеих микроРНК (дополнительная рис. 1d, e).

Lsy-6 также находится на крайнем конце распределения ТА для miRNAs у нематод и человека (). Чтобы предсказать TA в геноме, мы подсчитали количество сайтов в тщательно отобранном наборе различных 3’UTR.При рассмотрении конкретного типа клеток ТА генома была преобразована в ТА транскриптома с учетом относительных уровней каждой мРНК, несущей сайт, хотя на практике уровни ТА генома и транскриптома сильно коррелировали. Например, транскриптом TA для клеток HeLa (TA HeLa ) почти идеально коррелировал с геномом TA ( R 2 = 0,98, P <10 −100 , корреляционный тест Спирмена, дополнительная рис. 1f). При рассмотрении сайтов 8mer и 7mer-m8 (которые оба связаны с нуклеотидами 2–8) lsy-6 имели ТА генома, который занимал 2 и место среди 60 C.elegans семейств микроРНК и TA HeLa , что ставит его рядом с miR-23, который занимает 5 -е место среди 87 семейств позвоночных (и дополнительная рис. 1g).

Чтобы проверить гипотезу о том, что либо слабый SPS, либо высокий TA lsy-6 влияет на его способность нацеливаться, мы сделали три замены в начальном материале lsy-6 , которые изменили оба свойства. Три замены преобразовали семя lsy-6 в семя miR-142-3p (дополнительный рис.1a), что изменило прогнозируемый SPS на -7,70 ккал моль -1 , что было на -4,05 ккал моль -1 сильнее, чем у л.с.у.-6 , и близко к медианным значениям для консервативных микроРНК нематод и позвоночных () . Замены также изменили предсказанный TA на 10 2,957 сайтов в C. elegans и 10 3,207 сайтов у человека, значения ниже медианы консервативных miRNAs в обоих геномах (). При анализе с использованием репортеров с компенсаторными заменами в их исходных совпадениях котрансфекция этой миР-142 lsy-6 химерной миРНК репрессировала девять из 14 репортеров, часть в пределах, если не превышая, диапазона, ожидаемого в этой системе при использовании репортеров с анализируемые типы сайтов и контексты ().Повторение эксперимента с использованием полноразмерной последовательности miR-142-3p (дополнительный рисунок 1a) дало аналогичные результаты, указывающие на то, что последовательность miRNA за пределами начального региона не имеет отношения к репрессии как cog-1 3’UTR, так и другие C. elegans 3’UTR ().

Как и лсй-6 , миР-23 также имел низкий уровень прицеливания в нашей системе. Исследование 17 фрагментов 3’UTR человека, случайно выбранных из набора с двумя 7–8-нуклеотидными сайтами miR-23 (консервативными или неконсервативными), расположенными в пределах 700 нуклеотидов друг от друга, обнаружило, что только один фрагмент репрессируется miR-23. эндогенны клеткам HeLa или HepG2 (данные не показаны).Последующие эксперименты, сосредоточенные на шести UTR с наиболее благоприятными оценками контекста (дополнительная таблица 1), показали, что котрансфекция дополнительной миР-23a вызывает маргинальную репрессию, если вообще имеет место ().

Чтобы проверить, может ли увеличение SPS при снижении TA также улучшить способность миР-23a нацеливания, мы преобразовали две начальные пары A: U в две пары G: C (; дополнительная рис. 1a), что повысило предсказанный SPS с — 5,85 ккал моль -1 до -8,67 ккал моль -1 при снижении ТА с 5 -го самого высокого из 87 семейств позвоночных до уровня ниже самого низкого.При анализе этой miRNA, названной miR-CGCG, с использованием репортеров с компенсаторными заменами в их начальных совпадениях, спорадическая и маргинальная репрессия, наблюдаемая с UTR дикого типа, стала намного более устойчивой (14). Эти результаты показали, что miR-23a обладает низкой способностью нацеливания либо из-за ее слабого SPS, либо из-за ее высокой TA, либо из-за того и другого, тем самым расширяя наши результаты на miRNA млекопитающих и 3’UTR млекопитающих.

Разделение эффектов SPS и TA на нацеливание микроРНК

Чтобы начать дифференцировать потенциальные эффекты SPS от эффектов TA, мы рассмотрели взаимосвязь между этими двумя свойствами для всех 16 384 возможных гептамеров.При исследовании C. elegans 3’UTR эти свойства были сильно антикоррелированы ( R 2 = 0,680, P < 10 -100 , корреляционный тест Спирмена). При изучении 3’UTR млекопитающих взаимосвязь все еще была очень значимой, но существенное истощение динуклеотидов CG в транскриптоме позвоночных 31 привело к большему разбросу TA, что снизило коэффициенты корреляции как для человека (, R 2 = 0,121 , P < 10 -100 ) и мышь (дополнительный рис.2а, R 2 = 0,081, P < 10 −100 ). В общем, каждый дополнительный динуклеотид CG приводил к дополнительному уменьшению ТА на log ×10.

Разделение эффектов SPS и TA на способность нацеливания микроРНК. ( a ) Взаимосвязь между предсказанным SPS и геномной ТА для lsy-6 и 59 других консервативных микроРНК нематод (красные квадраты) и всех других гептамеров (голубые, синие, темно-синие или фиолетовые квадраты, обозначающие 0, 1, 2 или 3 динуклеотида CpG в гептамере соответственно).TA определяли как общее количество канонических 7–8-нуклеотидных сайтов (8mer, 7mer-m8 и 7mer-A1) в аннотированных 3’UTR. Значения SPS были предсказаны с использованием соответствующих сайтов 7mer-m8. ( b ) Взаимосвязь между предсказанными SPS и TA в 3’UTR человека для miR-23 и 86 других широко консервативных семейств miRNA позвоночных (красные квадраты). В противном случае, как в a . ( c ) Последовательности микроРНК и сайты-мишени протестированы в репортерных анализах этой фигуры. ( d ) Реакция репортеров с 3’UTR предсказанных мишеней lsy-6 , мутировавших таким образом, что их сайты соответствовали семени LTA- lsy-6 , которое было котрансфицировано как родственная миРНК.Неродственные сайты были для lsy-6 . В противном случае, как в . ( e ) 2,6-диаминопурин (DAP или D) — пара оснований урацила. ( f ) Ответ репортеров, использованных в d после совместной трансфекции D-LTA- lsy-6 в качестве родственной микроРНК. В противном случае, как в d . ( g ) Ответ репортеров, использованных после совместной трансфекции D-миР-23а в качестве родственной миРНК, наряду с результатами для миР-23а, которые были повторены параллельно. В противном случае, как в .

Чтобы проверить влияние TA на lsy-6 прицеливания, мы разработали версию lsy-6 с низким TA (LTA), которая имела две точечные замены в семени lsy-6 (; Доп. Инжир.1а). Замена U4 на C (замена U4C) вводила динуклеотид CG, тогда как другая замена, U2A, облегчала более позднее исследование SPS. Из-за динуклеотида CG у LTA- lsy-6 предсказанная TA HeLa была на 95% ниже, чем у lsy-6 , значение, которое было бы 3 rd самым низким среди консервативных семейств микроРНК позвоночных. Хотя замены также увеличивали SPS, предсказанный SPS -5,49 ккал моль -1 был все еще немного слабее, чем у miR-23, и значительно ниже медианы как для нематод, так и для консервативных miRNAs позвоночных ().При анализе с использованием репортеров с компенсаторными заменами в их начальных совпадениях LTA- lsy-6 репрессировал репортеры cog-1 и только три других (14). Два (F55G1.12 и C27H6.9) были репрессированы лишь незначительно (<1,3 раза), что напоминало маргинальную репрессию, обеспечиваемую miR-23 при использовании родственных сайтов, а для третьего, T20G5.9, большая часть явная репрессия была приписана нормализации результатов miR-1, которые в случае этого UTR были необычными (дополнительная рис.2г). Взятые вместе, результаты LTA- lsy-6 показали, что снижение TA само по себе недостаточно для обеспечения надежного навыка наведения на цель.

Чтобы увеличить SPS без изменения TA, мы заменили каждый из двух затравочных аденинов LTA- lsy-6 на 2,6-диаминопурин (DAP или D). DAP является аналогом аденина с экзоциклической аминогруппой в положении 2, что позволяет ему образовывать пары с урацилом с геометрией и термодинамической стабильностью, напоминающими пару G:C (12). Поскольку параметры ближайшего соседа не были определены для модельных дуплексов, содержащих пары D:U, мы оценили SPS, используя значения для пар A:U и добавив -0.9 ккал моль -1 для каждой пары D:U, так как это значение, приписываемое дополнительной водородной связи в модельных дуплексах 32 . При таком приближении D-LTA- lsy-6 миРНК имела прогнозируемый SPS -7,29 ккал моль -1 , который приближался к -7,87 ккал моль -1 , медиане предсказанного SPS консервативных миРНК позвоночных. При анализе с использованием тех же репортеров, что и для LTA- lsy-6 , D-LTA- lsy-6 подавлял семь из четырнадцати репортеров (14).Хотя репрессия была менее эффективной, чем наблюдаемая с семенами miR-142 (), репрессия была сильнее, чем наблюдаемая для LTA- lsy-6 , и на одном уровне с ожидаемой для miRNAs млекопитающих в этой системе при использовании репортеров с типами сайтов и сайтами проанализированы контексты.

Затем мы протестировали D-miR-23, в которой два аденина семян также были заменены на DAP, тем самым повышая прогнозируемый SPS с -5,85 ккал моль -1 до -7,65 ккал моль -1 . Пять из шести репортеров с сайтами miR-23 были репрессированы значительно сильнее D-miR-23a, чем miR-23a дикого типа (), тем самым демонстрируя благоприятный эффект для увеличения SPS в контексте очень высокой TA (93 рд. процентиль).Однако репрессия была все еще значительно ниже, чем репрессия miR-CGCG, по-видимому, потому, что у miR-CGCG была более низкая TA и несколько более сильный SPS (-8,67 ккал моль -1 ), хотя мы не можем исключить возможность того, что неприродный DAP в скомпрометированной активности микроРНК.

Таким образом, результаты с DAP-замещенными miRNAs показывают, что для miRNAs со слабым SPS увеличение SPS может повышать эффективность нацеливания, независимо от того, имеют ли эти miRNAs высокую или низкую TA. Поскольку замена DAP изменила предсказанный SPS без изменения сайтов в UTR, эти результаты показали, что низкая эффективность была связана со слабым SPS, а не с окклюзией сайтов РНК-связывающими белками, которые распознавали совпадения исходных микроРНК.Взятые вместе, результаты наших репортеров также предполагают, что снижение TA может еще больше повысить эффективность нацеливания, особенно для miRNAs с SPS от умеренного до сильного.

Глобальное влияние ТА и СФС на способность нацеливания

Чтобы изучить глобальное влияние ТА и СФС на нацеливание, мы собрали 175 опубликованных наборов данных микрочипов, которые отслеживали реакцию трансфекции миРНК или миРНК (сРНК) в клетки HeLa (дополнительная таблица 2). ). Наборы данных, сообщающие об эффектах sRNAs с одной и той же областью семян, были объединены, что дало результаты для 102 различных семян, которые охватывали широкий спектр TA и предсказывали SPS (13).Для каждого из этих 102 наборов данных мы определили среднее значение репрессии мРНК с одним 8-мерным сайтом 3’UTR и отсутствием других сайтов в сообщении, и нанесли эти значения на график относительно как TA HeLa , так и предсказанного SPS трансфицированной sRNA. (, верх). мРНК с более низким значением TA HeLa были более эффективными, чем с более высоким значением TA HeLa , а мРНК с более сильным прогнозируемым SPS были более эффективными, чем с более слабым прогнозируемым SPS ( P = 0,0006 и 0,0054 для TA HeLa и SPS, соответственно, корреляционный критерий Пирсона; ).При использовании множественной линейной регрессии для учета взаимной корреляции между TA HeLa и SPS корреляции все еще были по крайней мере незначительно значимыми для отдельных признаков ( P = 0,005 и 0,05, t-критерий;), что указывало на то, что оба свойства были независимо связаны с умением нацеливаться на сайты 3’UTR. Аналогичные результаты наблюдались для нацеливания на сайты 7mer-m8, 7mer-A1 и 6mer (и ).

Влияние ТА и SPS на эффективность нацеливания sRNA, как определено с использованием данных массива.( a ) Распределение TA HeLa и предсказанный SPS для мРНК из 102 массивов данных, проанализированных в этом исследовании (оранжевые квадраты), и мРНК из наборов данных, прошедших анализ обогащения мотивов (красные квадраты). В противном случае, как в . ( b ) Ответ экспрессированных мРНК с одним сайтом 3’UTR на родственную sRNA, показанный в отношении TA HeLa и предсказанный SPS. Значения кратности изменения наносятся на график в соответствии с ключом справа от каждого графика, сравнивая мРНК с одним сайтом указанного типа (и без дополнительных сайтов родственной мРНК в другом месте мРНК) с сайтами без сайта родственной мРНК; обратите внимание на разные масштабы для разных графиков.В областях перекрытия нанесены средние значения. Коэффициенты корреляции и значения P представлены в формате . ( c ) Ответ экспрессированных мРНК с одним сайтом ORF на родственную sRNA, показанный в отношении TA HeLa и предсказанный SPS. В противном случае, как в b . ( d ) Ответ мРНК с указанными одиночными сайтами при связывании родственной мРНК с помощью TA HeLa (верхняя панель) или предсказанного SPS (нижняя панель). Ключ указывает рассматриваемые данные, при этом первые квартили верхней панели содержат данные для мРНК с самой низкой TA HeLa , а нижняя панель включает данные для мРНК с самым сильным предсказанным SPS.Столбики погрешностей указывают на 95% доверительные интервалы.

Таблица 1

Взаимосвязь между средней репрессией мРНК и либо TA, либо прогнозируемым SPS для указанных типов сайтов, как определено по данным микрочипа ()

9 R 0,0054 0,84 9079
Местоположение и тип сайта Множественная линейная регрессия
Простая линейная регрессия
Несколько R 2 Значение P
ТА HeLa
СПС
Ta HELA SPS R 9 9 9

9 P

2 R 2 P Value
3’UTR 8мер 0.149 +0,0049 0,051 0,115 0,0006 0,076
3’UTR 7mer-m8 0,190 0,0081 0,0047 0,122 0,0003 0,131 0.0002
3’UTR 7Mer-A1 0.335 0,0009 2 × 10 -5 -5 0.196 3 × 10 -6 0.256 6 × 10 -8
3’UTR 6мер 0.177 0,039 0,0025 0,097 0,0014 0,141 0,0001
ORF 8mer 0,104 0,018 0,14 0,085 0,0030 0,052 0,021
ORF 7MER-M8 0.171 0.019 0.0054 0.103 0.103 0,0010 0.123 0,0003 0,0003
Orf 7mer-A1 0.135 0,010 0,073 0,106 0,0008 0,076 0,0052
ORF 6mer 0,228 0,010 0,0008 0,133 0,0002 0,174 1 × 10 — 5
5’UTR 8мер 0.004 0.004 0.75 0.62 0.002 0.004 0.64 0.003 0.59
5’UTR 7мер-M8 0.003 0,63 0,72 0,002 0,70 0,000
5’UTR 7mer-A1 0,012 0,60 0,49 0,007 0,41 0,009 0,35
5’UTR 6мер 0.011 0.011 0.32 0.32 0.001 0,74 0.011 0,29 0,29

Хотя как TA и SPS каждый значительно повлиял на целеустройство владения, вместе они объяснили меньшинство изменчивости ().Большая часть изменчивости может быть связана с факторами, не связанными с нацеливанием, такими как шум массива, дифференциальная эффективность трансфекции или дифференциальная загрузка или стабильность sRNA. Чтобы уменьшить изменчивость из этих источников, мы сосредоточились на 74 наборах данных, для которых ответные сообщения были значительно обогащены сайтами 3’UTR для трансфицированной sRNA (, красные квадраты; дополнительная таблица 2). С этими отфильтрованными наборами данных корреляции между уровнем владения навыком и как TA , HeLa , так и SPS были более сильными и наблюдались с аналогичной статистической значимостью, даже несмотря на то, что фильтрация уменьшила количество проанализированных данных и, возможно, предпочтительно отбрасывала наборы данных, для которых высокий уровень TA или слабый SPS препятствовал обнаружению. репрессии (дополнительный рис.3а, б и дополнительную таблицу 3).

Исследования, отслеживающие глобальные эффекты микроРНК на репрессию мишени, пришли к выводу, что сайты в открытых рамках считывания (ORF) могут опосредовать репрессию, но эффективность этих сайтов, как правило, меньше, чем у сайтов в 3’UTR 7,30,33, 34 . Чтобы изучить влияние TA и SPS на таргетинг в ORF, мы рассмотрели выраженные сообщения, которые имели один сайт ORF, но не имели дополнительных сайтов в остальной части сообщения. Для сайтов 7mer-m8 и 6mer средняя репрессия достоверно коррелирует как с TA HeLa , так и с предсказанным SPS, а для двух других сайтов в ORF средняя репрессия достоверно коррелирует с TA HeLa (и ).Реакция сайтов в 5’UTR не коррелировала значимо ни с TA, ни с предсказанным SPS (14), что согласуется с идеей, что 5’UTR содержат относительно мало эффективных сайтов 3 .

Далее мы рассмотрели количественное влияние TA и SPS на целеустремленность. Были рассмотрены одни и те же наборы мРНК с отдельными сайтами для родственных мРНК, и для каждого типа сайта и каждой области мРНК мРНК были объединены в квартили, ранжированные либо по низкой ТА, либо по сильному прогнозируемому SPS. Для каждого типа сайта сообщения в верхнем квартиле реагировали сильнее, чем в нижнем ().Различия обычно были существенными. Например, репрессия верхнего квартиля мРНК с сайтами 7mer-A1 соответствует средней репрессии мРНК с сайтами 7mer-m8, тогда как репрессия нижнего квартиля напоминает среднюю репрессию мРНК с сайтами 6mer.

Улучшенное предсказание цели miRNA

Одним из наиболее эффективных инструментов для предсказания цели miRNA млекопитающих является оценка контекста 30 . Оценки контекста используются для ранжирования предсказаний целевых микроРНК млекопитающих путем моделирования относительного вклада ранее идентифицированных признаков нацеливания, включая тип сайта, номер сайта, местоположение сайта, локальное содержание AU и 3′-дополнительное спаривание, для прогнозирования относительной репрессии мРНК с помощью Сайты 3’UTR 7 .Однако модель контекстной оценки не была разработана для учета различий между sRNAs, такими как TA или SPS, которые могут привести к более сильному нацеливанию сайтов одной miRNA по сравнению с сайтами другой (при условии равной экспрессии двух miRNAs).

Чтобы построить модель, подходящую для прогнозирования относительного ответа мишеней различных микроРНК, мы рассматривали TA и SPS как две независимые переменные при выполнении множественной линейной регрессии на 11 наборах данных микрочипов, которые ранее использовались для первоначальной разработки и обучения контекстной оценки. модель 7 .Другими параметрами были локальное содержание A-U, расположение сайта в пределах 3’UTR и 3′-дополнительное спаривание 7 . Для каждого типа сайта значительный вклад вносили TA и/или SPS (дополнительная таблица 4). Баллы, полученные с помощью этих моделей, были названы баллами контекста +, потому что они учитывают тип сайта и контекст, а также мастерство sRNA. Затем мы получили общую оценку контекста+ для каждой мРНК с сайтами 3’UTR, полагаясь на наблюдение, что множественные сайты обычно действуют независимо по отношению друг к другу 7 .

Прогностическая ценность новой модели была протестирована с использованием данных из наборов массивов данных, не использовавшихся для обучения модели, путем сравнения производительности прогнозируемых целей, ранжированных с использованием общих оценок контекста+, с показателями, ранжированными с использованием оценок исходной модели. Чтобы проверить, было ли какое-либо улучшение по сравнению с исходной моделью результатом обучения модели с помощью множественной линейной регрессии, а не простой линейной регрессии, мы также использовали множественную линейную регрессию для построения модели, которая учитывала только три параметра, использованные для построения исходной модели (только для контекста). баллы, дополнительная таблица 5).Для каждой модели предполагаемые мишени с сайтами из 7–8 нуклеотидов ранжировались по количеству баллов и распределялись по 10 интервалам. Оценки контекста+ показали лучшие результаты, чем оценки старого контекста, при прогнозировании ответа на мРНК (), давая значительно более сильную среднюю репрессию для двух верхних бинов ( P = 5 × 10 -56 и 3 × 10 -8 для ячеек 1 и 2 соответственно) и значительно более слабой репрессии в нижних четырех ячейках ( P = 6 × 10 −10 , 1,5 × 10 −5 , 1 × 10 −7 и 3 × 10 -4 для интервалов 7, 8, 9 и 10 соответственно, критерий суммы рангов Уилкоксона).Улучшенная специфичность также была проиллюстрирована кривыми ROC (дополнительная рис. 4a).

Прогностическая эффективность модели context+, в которой помимо контекста сайта учитывается наличие miRNA или siRNA. ( a ) Улучшенные прогнозы для мРНК с каноническими 7–8-нуклеотидными сайтами 3’UTR. Предсказанные взаимодействия между мРНК и родственной мРНК были распределены по 10 одинаково заполненным ячейкам на основе общих оценок контекста, полученных с использованием указанной модели (ключ), причем первая ячейка включала взаимодействия с наиболее благоприятными оценками.Для каждого бина нанесено среднее изменение мРНК на массивах (планки погрешностей, 95% доверительные интервалы). ( b ) Прогноз ответных взаимодействий с участием мРНК только с сайтами 3’UTR 6mer. В противном случае, как в a . ( c ) Прогноз ответных взаимодействий с участием мРНК, по крайней мере, с одним 8-мерным сайтом ORF, но без сайтов 3’UTR. В противном случае, как в a . ( d ) Влияние ТА и SPS на направленный siRNA нокдаун желаемой мишени. Эффективность нокдауна активности люциферазы построена для 2431 миРНК, трансфицированных в клетки h2299 38 .Эффективность оценивается по линейной шкале (ключевой показатель), положительные и отрицательные контроли имеют значения 0,900 и 0,354 соответственно 38 .

Поскольку большинство сайтов 6mer и сайтов ORF либо не реагируют, либо лишь незначительно реагируют на miRNA, алгоритмы, которые достигают полезной специфичности предсказания, делают это за счет игнорирования этих сайтов 3 . Обнаружив, что низкая TA и сильный SPS коррелируют со значительно большей эффективностью этих маргинальных сайтов (), мы расширили оценки контекста + до 6-мерных сайтов.Для модели context+ верхний бин мРНК с 6-мерными сайтами 3’UTR, но без более крупных сайтов () имел среднюю репрессию, аналогичную наблюдаемой для третьего бина мРНК с 7–8-нуклеотидными сайтами 3’UTR (; кривые ROC, дополнительные рис. 4б). Оценки только для контекста и контекста + также были получены для сайтов ORF, изменяя только параметр местоположения сайта, который не был применим для сайтов ORF, поскольку он объясняет более низкую эффективность сайтов вблизи середины длинных 3’UTR 7 . В ОРС мы обнаружили, что сайты дальше от стоп-кодона, как правило, менее эффективны, и поэтому расстояние от стоп-кодона (линейно масштабированное расстояние от 0 до ≥1500 нуклеотидов) было включено в качестве параметра.Хотя эта модель контекста+ не была значительно лучше, чем модель только контекста для сайтов ORF (возможно, потому, что в регрессии использовались данные только по 11 микроРНК), обе модели имели прогностическую ценность. При сравнении мРНК, по крайней мере, с одним 8-мерным сайтом ORF (), те, которые ранжированы в верхней ячейке, имели среднюю репрессию, аналогичную наблюдаемой для второй или третьей ячейок мРНК с 7-8-нуклеотидными сайтами 3’UTR ().

В целом, наши результаты показали, что учет TA и SPS может значительно улучшить прогнозирование мишеней miRNA при объединении результатов нескольких sRNA.Обучение на 11 наборах данных трансфекции микроРНК, которые использовались для оценки исходного контекста, было подходящим для демонстрации улучшения, которого можно было бы достичь, принимая во внимание TA и SPS. Однако мы пришли к выводу, что обучение на 74 отфильтрованных наборах данных может создать более точную контекстную модель, которая будет использоваться для количественного прогнозирования вытеснения. Как и ожидалось, корреляции для всех четырех параметров имели еще большую статистическую значимость при обучении модели на большем количестве данных (дополнительная таблица 6).Хотя подход SVM (машина опорных векторов) в принципе должен давать еще лучшие результаты за счет учета эффектов, потерянных при множественной линейной регрессии из-за мультиколлинеарности, при использовании SVM не наблюдалось повышения производительности (дополнительный рисунок 4c – e). Поэтому мы использовали множественную линейную регрессию, поскольку она позволяла более удобно рассчитывать оценки контекста + (дополнительный рис. 5a). Мы будем использовать эти новые оценки в версии 6.0 TargetScan (targetscan.org).

Дополнительные соображения

Предупреждение экспериментов с репортером заключалось в том, что изменения последовательности микроРНК, предназначенные для изменения TA или SPS, могли непреднамеренно влиять на другие факторы, такие как стабильность микроРНК или ее загрузка в комплекс молчания.Однако наш вычислительный анализ 102 массивов данных также показал, что TA и SPS независимо друг от друга влияют на эффективность таргетинга. Следовательно, если различия в стабильности или нагрузке sRNA искажают интерпретацию наших результатов, эти различия должны коррелировать либо с предсказанным SPS, либо с TA. Анализ опубликованных данных о сверхэкспрессии микроРНК противоречил этой возможности, не обнаружив никакой корреляции между накоплением микроРНК и прогнозируемым SPS или TA (дополнительная рис. 3c, d). Кроме того, эксперименты по изучению РНК, совместно очищающихся с AGO2, показали, что разница в эффективности, наблюдаемая между lsy-6 и miR-142 lsy-6 , не была просто связана с меньшим накоплением lsy-6 в комплексе сайленсинга. (Дополнительный рис.1 м–с).

Обсуждение

Корреляция между высоким уровнем СФС и низким уровнем ТА поставила в тупик предыдущие попытки изучить влияние этих параметров на эффективность таргетинга, при этом одно исследование включало СФС, а не ТА 24 , а другие исследования включали ТА, а не СФС 27,28 . Наши результаты показали, что оба параметра влияют на эффективность, и разрешили одну из загадок нацеливания микроРНК: неспособность lsy-6 репрессировать все, кроме одной, из 14 исследованных мРНК, совпадающих с семенами.Предыдущие решения предполагали, что модель нацеливания на основе семян ненадежна 23 или что сайты 13 невосприимчивых мРНК попадают в недоступную структуру UTR 18 . Наша работа показывает, что фактическим решением является необычно слабый SPS и высокая TA lsy-6 miRNA. Изменение этих параметров, чтобы они напоминали параметры более типичных miRNAs, придавало типичное мастерство нацеливания на основе семян, даже несмотря на то, что сайты находились в их исходных контекстах UTR, тем самым демонстрируя, что ни надежность нацеливания на основе семян, ни доступность сайтов не были проблемой.

МикроРНК с необычно слабым предсказанным SPS и необычно высокой TA, такие как miR-23 и lsy-6 , по-видимому, имеют относительно небольшое количество мишеней. В самом деле, lsy-6 может иметь только одну биологическую мишень, мРНК cog-1 — крайнее исключение из хорошо подтвержденного вывода о том, что микроРНК многоклеточных животных обычно имеют десятки, если не сотни предпочтительно консервативных мишеней 4,8, 35,36 . Решение загадки того, почему так мало мРНК реагируют на lsy-6 , выдвигает на передний план вторую загадку, до сих пор неразгаданную: как cog-1 3’UTR так эффективно распознается и репрессируется микроРНК с такой слабой способностью к нацеливанию? ? Этот UTR имеет два 8-мерных сайта, которые в силу их консервативности делают cog-1 главной предполагаемой мишенью lsy-6 (ссылка. 3 ), но это только часть ответа 37 . Улучшение модели контекстной оценки для учета дифференциальных SPS и TA разных микроРНК поможет сосредоточить внимание на предсказанных мишенях микроРНК с более типичными навыками, но оставит нерешенной проблему того, как предсказать несколько биологических сайтов менее квалифицированных. miRNAs без обращения к сохранению сайта.

МикроРНК с очень высокой ТА, такие как lsy-6 или миР-23 , , и микроРНК с очень низкой ТА, такие как миР-100 или миР-126, две широко консервативные микроРНК позвоночных, содержащие динуклеотиды CG в своих семенах (дополнительная таблица 7), по-видимому, представляют собой две стратегии нацеливания на очень небольшое количество генов, осуществляемые на противоположных концах спектра ТА.Для миРНК с очень высокой ТА для регуляции требуются другие особенности UTR, фланкирующие сид-сайты, как показано для lsy-6 регуляции cog-1 (ссылка 37 ), тогда как миРНК с очень низкой ТА просто имеют гораздо меньше потенциальных целевых сайтов для начала.

Наши результаты также имеют отношение к тому, как siRNA может быть разработана для уменьшения количества нецелевых клеток. Предыдущие исследования предполагали, что нецелевые объекты могут быть уменьшены путем создания siRNA с низким уровнем TA 27 или слабым SPS 24 , а наши результаты показали, что нецелевые объекты могут быть в значительной степени устранены путем создания siRNAs как с высоким TA, так и со слабым SPS.Одна проблема, тем не менее, заключается в том, что такие siRNAs могут также быть неэффективными при распознавании желаемой мРНК-мишени, потому что спаривание с этой мишенью будет зародышеобразоваться при совпадении со слабым SPS и может титроваться многими другими мРНК с совпадениями seed. Чтобы исследовать эту проблему, мы изучили опубликованный набор данных высокопроизводительных анализов люциферазы, сообщающих об ответе на 2431 различные siRNAs 38 . siРНК со слабым предсказанным SPS сбивали желаемую мишень более эффективно, чем те, что с сильным предсказанным SPS (; P = <10 -100 , корреляционный тест Пирсона), предположительно из-за предпочтительной загрузки в комплекс сайленсинга 39,40 .Более того, высокая TA не ставила под угрозу желаемую эффективность нацеливания даже после поправки на взаимную корреляцию между TA и SPS ( P = 0,16, корреляционный критерий Пирсона). Следовательно, проектирование siRNAs с высокой TA и слабым SPS должно свести к минимуму нецелевые эффекты без ущерба для нокдауна желаемой мишени.

Высоко экспрессируемые мРНК склонны к эволюционному истощению сайтов для совместной экспрессии miRNAs, явление, отчасти объясняемое возможностью того, что эти мРНК могут в противном случае титровать miRNAs от их предполагаемых мишеней 12,41,42 .Титрование также может обеспечить полезный механизм для клеток, чтобы регулировать активность miRNA, как показано IPS1 титрованием miR-399 в Arabidopsis 25 . Благоприятное титрование даже было предложено для объяснения того, почему сохраняется так много сайтов miRNA , 43, . Однако, поскольку наиболее предпочтительно консервативные сайты попадают в мРНК с низкой или умеренной экспрессией, и поскольку каждый из этих сайтов включает лишь крошечную долю ТА, каждый из них может оказывать самое большее соответственно незначительное влияние на эффективную концентрацию миРНК — намного меньше, чем необходимо выборочно сохранить сайт.Хотя функции титрования не могут объяснить сохранения большей части сайтов, ТА может быть динамичной во время развития с интересными последствиями. Напр., увеличение miRNA во время развития часто будет сопровождаться снижением ее транскриптомной TA, следствием эволюционного истощения сайтов в мРНК, коэкспрессирующихся на высоких уровнях с miRNA 12,42 . Это сопутствующее снижение TA обострило бы переход между не-подавленным и подавленным состояниями целей.

При прогнозировании SPS мы использовали параметры, полученные из модельных дуплексов РНК, которые, по-видимому, занижали фактическую аффинность сегментов РНК, спаренных с Argonaute-связанными затравочными областями 2,3,44,45 . Степень, в которой Argonaute усиливает сродство, может различаться для разных последовательностей семян. Эти потенциальные различия, однако, не мешали нашему обнаружению влияния СФС на умение нацеливаться. Таким образом, наше исследование предоставило нижнюю границу фактического влияния SPS, а также подход к изучению его полной величины после того, как будут известны точные SPS комплексов, связанных с Argonaute.

Методы

Репортерные анализы

Для репортерных анализов lsy-6 клетки HeLa высевали в 24-луночные планшеты по 5 × 10 4 клеток на лунку. Через 24 часа каждую лунку трансфицировали 20 нг репортера TK- Renilla -люциферазы (pIS1) 46 , 20 нг контрольного репортера люциферазы светлячка (pIS0) 46 и 25 нМ дуплекса миРНК (Dharmacon) (дополнительно). Рис. 1а), с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Для анализов репортера miR-23 условия были такими же, за исключением трансфицированной ДНК: 10 нг SV40- Renilla -люциферазы-репортера (pIS2) 46 , 25 нг светлячков-люциферазы контрольного репортера (pIS0), 1.25 мкг ДНК-носителя pUC19. Активность люциферазы измеряли через 24 часа после трансфекции с помощью теста Dual-Luciferase Assay (Promega) и люминометра для микропланшетов Veritas (Turner BioSystems). Для каждой тестируемой конструкции было проведено четыре независимых эксперимента, каждый с тремя биологическими повторами. Для контроля эффективности трансфекции активность светлячков делили на активность Renilla . Значения Renilla для конструкций с сайтами, совпадающими с родственной миРНК, затем нормализовали к среднему геометрическому значений для в остальном идентичных конструкций, в которых сайты были мутированы.Чтобы контролировать различия, не связанные с родственной миРНК, отношения были дополнительно нормализованы к отношениям для тех же конструкций, протестированных с неродственной миРНК, миР-1. Эти дважды нормализованные результаты представлены на основных рисунках; однократно нормализованные результаты представлены на дополнительных рисунках 1h – l и 2d – f.

Конструкции

3’UTR lsy-6 предсказанные мишени 23 были субклонированы в сайты XbaI и EagI в pIS1, а 3’UTR миР-23-предикативных мишеней были клонированы в сайты SacI и SpeI в pIS2 после амплификации (последовательности UTR, дополнительная таблица 1).Мутации вводили с помощью Quikchange (Stratagene) и подтверждали секвенированием.

Предсказанный SPS

SPS был предсказан с использованием термодинамических параметров ближайшего соседа, включая штраф для терминальных пар A:U 32 . Вклад A в положении 1 сайтов 8mer и 7mer-A1 не был включен, потому что этот A не спаривается с miRNA 4 и, таким образом, не ожидается, что его вклад будет различаться предсказуемым образом для разных miRNA. При проведении линейного регрессионного анализа прогнозируемый SPS позиций 2–8 использовался для сайтов 8mer и 7mer-m8, а прогнозируемый SPS позиций 2–7 использовался для сайтов 7mer-A1 и 6mer.При назначении единого значения для 7–8-нуклеотидных сайтов (7mer-A1, 7mer-m8 и 8mer) использовалось средневзвешенное значение трех типов сайтов. Это среднее значение SPS рассчитывали как [(6mer SPS)(7mer-A1 TA) + (7mer-m8 SPS)(7mer-m8 TA + 8mer TA)] ÷ (7mer-A1 TA + 7mer-m8 TA + 8mer TA).

Эталонные мРНК

Для создания списка уникальных мРНК полноразмерные мРНК человека, полученные из баз данных RefSeq 47 и H-Invitational 48 , были сопоставлены с геномом человека 49 (hg18) с использованием BLAT 50 16 05 программного обеспечения и обработаны, как описано, для представления каждого гена изоформой мРНК с самой длинной UTR 30 .Эти уникальные полноразмерные мРНК, каждая из которых была представлена ​​геномной последовательностью своих экзонов (поскольку геномная последовательность была более высокого качества, чем последовательность мРНК), были «эталонными мРНК» (дополнительная таблица 8). Полноразмерные мРНК мыши были получены из баз данных RefSeq 47 и FANTOM DB 51 , сопоставлены с геномом мыши 52 (mm9) и обработаны аналогичным образом. Для C. elegans и D. melanogaster мы получили последовательности 3’UTR из TargetScan (targetscan.орг) 22,53 . Зрелые последовательности микроРНК были загружены с веб-сайта miRBase 54 .

Обработка микрочипов и картирование эталонных мРНК

Мы собрали опубликованные наборы данных, сообщающие об ответе мРНК HeLa через 24 часа после трансфекции 100 нМ мРНК, с использованием матриц Agilent (двухцветная платформа), за исключением наборов данных, для которых либо несколько мРНК трансфицировались одновременно, либо трансфицированные РНК содержали химически модифицированные нуклеотиды (дополнительная таблица 2).Если были доступны последовательности зондов для платформы массива, их картировали в геномных местоположениях в геноме человека с использованием программного обеспечения BLAT 50 . Для некоторых массивов (например, {«type»:»entrez-geo»,»attrs»:{«text»:»GSE8501″,»term_id»:»8501″}}GSE8501) последовательности зондов были недоступны, но ассоциированная кДНК или идентификаторы последовательности EST были доступны. В таких случаях геномные координаты кДНК и EST, полученные из UCSC Genome Browser 55 , использовались так, как если бы они были координатами зондов массива.Каждый зонд и связанное с ним значение кратности изменения мРНК были сопоставлены с эталонной мРНК, имеющей наибольшее перекрытие с геномными координатами зонда, ≥15 оснований. Когда несколько зондов картировали с одной эталонной мРНК, использовали среднее кратное изменение. Чтобы избежать анализа мРНК, не экспрессированных в клетках HeLa, рассматривались только мРНК с сигналом выше медианы в образцах с псевдотрансфекцией. Для каждого массива медиана кратности изменения эталонных мРНК без какого-либо 6-8-нуклеотидного сайта использовалась для нормализации кратности изменений всех эталонных мРНК.Чтобы скорректировать глобальную связь между изменением укладки мРНК и содержанием AU в транскрипте мРНК, была применена фильтрация LOWESS с использованием функции malowess () в MATLAB (дополнительная таблица 9). Для некоторых массивов трансфицированная sRNA предназначена для нацеливания на почти идеально совпадающие (≥18 нуклеотидов) мРНК, и в этом случае эти предполагаемые мишени были исключены из анализа.

Анализ обогащения мотивов для фильтрации массива

Для оценки наборов данных массива мы провели анализ обогащения мотивов с использованием точного критерия Фишера для таблицы сопряженности 2 × 2, заполненной на основе того, имеет ли эталонная мРНК 7-мерный мотив для родственной мРНК. в его 3’UTR и входит ли он в число 5% наиболее подавляемых мРНК.Если на нескольких массивах исследовали эффекты трансфекции мРНК с идентичными исходными областями (положения 2–8), значение P точного теста Фишера для обогащения сайтов (с учетом любого из двух 7-мерных сайтов и выбора сайта с более низким значением P) было оценивали для каждого массива, и массив со средним значением P был выбран для представления этой исходной области, что дало 102 репрезентативных массива (дополнительная таблица 2). Чтобы получить отфильтрованный набор данных, этот тест был повторен для 16 384 7-меров, и массивы были сохранены, если мотивом, наиболее значимо связанным с подавлением, был сайт 7-мер-m8 или 7-мер-A1 трансфицированной мРНК; 74 массива прошли этот фильтр (дополнительная таблица 2).Результаты множественной линейной регрессии и других анализов были устойчивы к выбору порога (проверены другие пороги, 10, 15 и 20%; данные не показаны).

TA

TA в транскриптоме человека рассчитывали как количество неперекрывающихся сайтов 3’UTR 8mer, 7mer-m8 и 7mer-A1 в эталонных мРНК. Аналогичный процесс использовали для расчета TA у мышей C. elegans и D. melanogaster . Для расчета TA HeLa каждый сайт был взвешен на основе данных mRNA-Seq 33 .Прогнозируемые значения SPS и TA для всех гептамеров у C. elegans , человека и HeLa, мыши и D. melanogaster представлены в дополнительной таблице 10. Прогнозирование мишени

миРНК и анализ эффективности миРНК

Оценки контекста были рассчитаны для родственных сайтов эталонных мРНК с использованием параметров простой линейной регрессии, о которых сообщалось ранее 7 . Перед подгонкой баллы по каждому параметру были оценены по шкале от 0 до 1 (дополнительная рис. 5b).Чтобы учесть тип сайта без усложнения нескольких сайтов, модели были разработаны для каждого типа отдельно с использованием мРНК только с одним сайтом для родственной миРНК (дополнительная рис. 5c). Множественные модели линейной регрессии для контекста и контекста+ были рассчитаны с использованием функции lm() в пакете R версии 2.11.1

.

  • Амброс В. Функции животных микроРНК. Природа 431 , 350–355 (2004).

    КАС Статья Google ученый

  • Бартель Д.П. МикроРНК: геномика, биогенез, механизм и функция. Cell 116 , 281–297 (2004).

    КАС Статья Google ученый

  • Бартель Д.П. МикроРНК: распознавание мишеней и регуляторные функции. Cell 136 , 215–233 (2009).

    КАС Статья Google ученый

  • Льюис, Б. П., Бердж, К. Б. и Бартел, Д. П. Консервативное спаривание семян, часто окруженное аденозинами, указывает на то, что тысячи генов человека являются мишенями для микроРНК. Cell 120 , 15–20 (2005).

    КАС Статья Google ученый

  • Бреннеке Дж., Старк А., Рассел Р.Б. и Коэн С.М.Принципы распознавания микроРНК-мишеней. PLoS Биол. 3 , е85 (2005).

    Артикул Google ученый

  • Крек А. и др. Комбинаторные прогнозы мишеней микроРНК. Нац. Жене. 37 , 495–500 (2005).

    КАС Статья Google ученый

  • Гримсон, А. и др. Специфичность нацеливания микроРНК у млекопитающих: детерминанты помимо спаривания семян. Мол. Ячейка 27 , 91–105 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Фридман Р.К., Фарх К.К., Бердж С.Б. и Бартель Д.П. Большинство мРНК млекопитающих являются консервативными мишенями для микроРНК. Рез. генома. 19 , 92–105 (2009).

    КАС Статья Google ученый

  • Шин, К. и др. Расширение кода нацеливания микроРНК: функциональные сайты с центрированным спариванием. Мол. Ячейка 38 , 789–802 (2010).

    КАС Статья Google ученый

  • Лим Л.П. и др. Анализ микрочипов показывает, что некоторые микроРНК подавляют большое количество мРНК-мишеней. Природа 433 , 769–773 (2005).

    КАС Статья Google ученый

  • Krützfeldt, J. et al. Замалчивание микроРНК in vivo с помощью «антагомиров». Природа 438 , 685–689 (2005).

    Артикул Google ученый

  • Фарх, К.К. и другие. Широко распространенное влияние микроРНК млекопитающих на репрессию и эволюцию мРНК. Наука 310 , 1817–1821 (2005).

    КАС Статья Google ученый

  • Хиральдез, А.Дж. и другие. МиР-430 рыбок данио способствует деаденилированию и клиренсу материнских мРНК. Наука 312 , 75–79 (2006).

    КАС Статья Google ученый

  • Nielsen, C.B. et al. Детерминанты нацеливания эндогенных и экзогенных микроРНК и киРНК. РНК 13 , 1894–1910 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Робинс, Х., Ли, Ю. и Пэджетт, Р. В. Включение структуры для прогнозирования целей микроРНК. Проц. Натл. акад. науч. США 102 , 4006–4009 (2005 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Чжао Ю., Самал Э. и Сривастава Д. Фактор ответа сыворотки регулирует специфичную для мышц микроРНК, которая нацелена на Hand2 во время кардиогенеза. Природа 436 , 214–220 (2005).

    КАС Статья Google ученый

  • Кертеш М., Iovino, N., Unnerstall, U., Gaul, U. & Segal, E. Роль доступности сайта в распознавании мишени микроРНК. Нац. Жене. 39 , 1278–1284 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Лонг, Д. и др. Мощное влияние целевой структуры на функцию микроРНК. Нац. Структура Мол. биол. 14 , 287–294 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Хаммелл, М.и другие. mirWIP: прогнозирование мишени микроРНК на основе транскриптов, обогащенных рибонуклеопротеинами, содержащих микроРНК. Нац. Методы 5 , 813–819 (2008).

    КАС Статья Google ученый

  • Saetrom, P. et al. Ограничения расстояния между сайтами-мишенями микроРНК диктуют эффективность и кооперативность. Рез. нуклеиновых кислот. 35 , 2333–2342 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Кедде, М.и другие. РНК-связывающий белок Dnd1 ингибирует доступ микроРНК к мРНК-мишени. Cell 131 , 1273–1286 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Руби, Дж.Г. и другие. Эволюция, биогенез, экспрессия и целевые предсказания существенно расширенного набора микроРНК Drosophila . Рез. генома. 17 , 1850–1864 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Дидиано, Д.& Hobert, O. Идеальное спаривание семян не является в целом надежным предиктором взаимодействий miRNA-мишень. Нац. Структура Мол. биол. 13 , 849–851 (2006).

    КАС Статья Google ученый

  • Уи-Тей, К., Наито, Ю., Ниши, К., Джуни, А. и Сайго, К. Термодинамическая стабильность и спаривание оснований Уотсона-Крика в затравочном дуплексе являются основными факторами, определяющими эффективность Нецелевой эффект, основанный на миРНК. Рез. нуклеиновых кислот. 36 , 7100–7109 (2008 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Franco-Zorrilla, J.M. et al. Мимикрия мишени обеспечивает новый механизм регуляции активности микроРНК. Нац. Жене. 39 , 1033–1037 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Эберт, М.С., Нейлсон, Дж.Р. и Шарп, П.А. МикроРНК-губки: конкурентные ингибиторы малых РНК в клетках млекопитающих. Нац. Методы 4 , 721–726 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Anderson, E.M. et al. Экспериментальное подтверждение важности частоты семенного комплемента для специфичности миРНК. РНК 14 , 853–861 (2008).

    КАС Статья Google ученый

  • Арви, А., Ларссон Э., Сандер С., Лесли К.С. и Маркс Д.С. Обилие мРНК-мишени снижает активность микроРНК и киРНК. Мол. Сист. биол. 6 , 363 (2010).

    Артикул Google ученый

  • Родригес, А. и др. Потребность в bic/микроРНК-155 для нормальной иммунной функции. Наука 316 , 608–611 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Пэк, Д.и другие. Влияние микроРНК на выход белка. Природа 455 , 64–71 (2008).

    КАС Статья Google ученый

  • Берд А. Паттерны метилирования ДНК и эпигенетическая память. Гены Дев. 16 , 6–21 (2002).

    КАС Статья Google ученый

  • Ся, Т. и др. Термодинамические параметры для расширенной модели ближайшего соседа для образования дуплексов РНК с парами оснований Уотсона-Крика. Биохимия 37 , 14719–14735 (1998).

    КАС Статья Google ученый

  • Гуо, Х., Инголия, Н.Т., Вайсман, Дж.С. и Бартель, Д.П. МикроРНК млекопитающих преимущественно снижают уровни мРНК-мишеней. Природа 466 , 835–840 (2010).

    КАС Статья Google ученый

  • Selbach, M. et al. Широко распространенные изменения в синтезе белка, индуцированные микроРНК. Природа 455 , 58–63 (2008).

    КАС Статья Google ученый

  • Лалл, С. и др. Полногеномная карта консервативных мишеней микроРНК у C. elegans . Курс. биол. 16 , 460–471 (2006).

    КАС Статья Google ученый

  • Ян, К.Х., Фридман, Р.К., Руби, Дж.Г. и Бартель, Д.П. Формирование, регуляция и эволюция Caenorhabditis elegans 3′ UTR. Природа 469 , 97–101 (2011).

    КАС Статья Google ученый

  • Дидиано, Д. и Хоберт, О. Молекулярная архитектура 3′-UTR, регулируемой микроРНК. РНК 14 , 1297–1317 (2008).

    КАС Статья Google ученый

  • Huesken, D. et al. Дизайн полногеномной библиотеки миРНК с использованием искусственной нейронной сети. Нац. Биотехнолог. 23 , 995–1001 (2005).

    КАС Статья Google ученый

  • Schwarz, D.S. et al. Асимметрия в сборке ферментного комплекса РНКи. Cell 115 , 199–208 (2003).

    КАС Статья Google ученый

  • Хворова А., Рейнольдс А. и Джаясена С.Д. Функциональные siRNAs и miRNAs обнаруживают смещение нитей. Cell 115 , 209–216 (2003).

    КАС Статья Google ученый

  • Бартель Д.П. и Чен, К.З. Микроменеджеры экспрессии генов: потенциально широко распространенное влияние микроРНК многоклеточных животных. Нац. Преподобный Жене. 5 , 396–400 (2004).

    КАС Статья Google ученый

  • Старк А., Бреннеке Дж., Бушати Н., Рассел, Р.Б. и Коэн, С.М. МикроРНК животных придают устойчивость экспрессии генов и оказывают значительное влияние на эволюцию 3’UTR. Cell 123 , 1133–1146 (2005).

    КАС Статья Google ученый

  • Seitz, H. Новое определение целей микроРНК. Курс. биол. 19 , 870–873 (2009).

    КАС Статья Google ученый

  • Амерес, С.Л., Мартинес Дж. и Шредер Р. Молекулярная основа распознавания и расщепления РНК-мишени человеческим RISC. Cell 130 , 101–112 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Паркер Дж.С., Паризотто Э.А., Ван М., Роу С.М. и Барфорд, Д. Усиление этапа распознавания семян-мишеней при молчании РНК с помощью доменного белка PIWI/MID. Мол. Ячейка 33 , 204–214 (2009).

    КАС Статья Google ученый

  • Льюис Б.П., Ши, И.Х., Джонс-Роудс, М.В., Бартел, Д.П. и Бердж, С. Б. Прогнозирование мишеней микроРНК млекопитающих. Cell 115 , 787–798 (2003).

    КАС Статья Google ученый

  • Прюитт, К.Д., Кац, К.С., Сикотт, Х. и Маглотт, Д.Р. Представляем RefSeq и LocusLink: кураторские ресурсы генома человека в NCBI. Тенденции Жене. 16 , 44–47 (2000).

    КАС Статья Google ученый

  • Иманиши Т.и другие. Интегративная аннотация 21 037 генов человека, подтвержденная полноразмерными клонами кДНК. PLoS Биол. 2 , е162 (2004).

    Артикул Google ученый

  • Ландер Э.С. и другие. Начальная последовательность и анализ человеческого генома. Природа 409 , |860–921 (2001).

    КАС Статья Google ученый

  • Кент, ЗападнаяJ. BLAT – инструмент выравнивания, аналогичный BLAST. Рез. генома. 12 , 656–664 (2002).

    КАС Статья Google ученый

  • Okazaki, Y. et al. Анализ транскриптома мыши на основе функциональной аннотации 60 770 полноразмерных кДНК. Природа 420 , 563–573 (2002).

    Артикул Google ученый

  • Уотерстон, Р.Х. и др. Первоначальное секвенирование и сравнительный анализ генома мыши. Природа 420 , 520–562 (2002).

    КАС Статья Google ученый

  • Руби, Дж.Г. и другие. Крупномасштабное секвенирование выявило 21U-RNAs и дополнительные микроРНК и эндогенные siRNAs у C. elegans . Cell 127 , 1193–1207 (2006).

    КАС Статья Google ученый

  • Гриффитс-Джонс, С., Сайни, Х.К., ван Донген, С. и Энрайт, А.Дж. miRBase: инструменты для геномики микроРНК. Рез. нуклеиновых кислот. 36 , Д154–Д158 (2008 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Rhead, B. et al. База данных UCSC Genome Browser: обновление 2010 г. Nucleic Acids Res. 38 , Д613–Д619 (2010 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Стратегии слабого связывания для достижения регио- и сайт-селективных преобразований

    https://doi.org/10.1016/j.chempr.2021.12.012Получить права и содержание

    Общая картина

    Слабые связывающие взаимодействия широко распространены во многих процессах молекулярного распознавания и самосборки в биологии. Использование синергетических слабосвязывающих взаимодействий ферментов для проведения очень сложных регио- и сайт-селективных преобразований молекул — это подвиг, на который природе потребовались миллиарды лет. Это замечательное мастерство молекулярного редактирования уже давно побуждает химиков разрабатывать стратегии слабой связи для контроля селективности химических реакций.Опираясь на различные динамические взаимодействия ковалентных и нековалентных связей, в дополнение к разработке пользовательских матриц и макроциклических рецепторов, регио- и сайт-селективные реакции становятся все более простыми, надежными и универсальными. Эти возникающие стратегии будут все чаще использоваться при решении задач в производстве важных для промышленности и фармацевтики соединений, а также при разработке новых материалов для использования в производстве устройств для завтрашнего дня.

    Резюме

    Способность идентифицировать и избирательно трансформировать сходные структурные фрагменты в молекулах в заданном направлении по сравнению со всеми другими возможными направлениями остается фундаментальной проблемой в связи с ростом и охватом синтетической химии. Быстро развивающийся подход к этой цели заключается в использовании слабых связывающих взаимодействий, включая как нековалентные, так и динамические ковалентные связи, для контроля избирательности региона и сайта. Вдохновившись реакциями, катализируемыми ферментами, химики разработали широкий спектр стратегий слабого связывания для облегчения регио- и сайт-селективных трансформаций без необходимости введения дополнительных ручек в молекулярные каркасы.Здесь, классифицируя эти протоколы слабой связи по четырем категориям, а именно стратегии дестабилизации связи, маскировки, предварительной организации и шаблонизации, мы обобщаем достижения, достигнутые за последние два десятилетия, подчеркивая их относительную простоту в продвижении региональных связей. и сайт-селективные реакции, которые в противном случае было бы трудно осуществить на молекулах.

    Ключевые слова

    Ключевые слова

    Supramolecular Catalyize

    Неколентные связывающие взаимодействия

    Динамические ковалентные облигации

    Предварительная организация

    Pre-организация

    Nanonoconfinement

    Host-Guest Chemistry

    Regioselectivity

    Цели устойчивого развития ООН

    SDG12: Ответственное потребление и производство

    SDG3: Хорошее здоровье и благополучие

    Рекомендуемые статьиСсылки на статьи (0)

    Полный текст

    © 2021 Elsevier Inc.| Поиск по дереву Перейти к основному содержанию

    .gov означает, что это официально.
    Веб-сайты федерального правительства часто заканчиваются на .gov или .mil. Прежде чем делиться конфиденциальной информацией, убедитесь, что вы находитесь на сайте федерального правительства.

    Сайт защищен.
    https:// гарантирует, что вы подключаетесь к официальному веб-сайту и что любая предоставленная вами информация зашифрована и безопасно передана.

    Тип публикации:

    Научный журнал (JRNL)

    Первичная(ые) станция(и):

    Исследовательская станция Скалистых гор

    Источник:

    Экологические приложения.15(2): 651-661.

    Описание

    В ответ на серьезную угрозу, которую экзотические виды представляют для природных систем, большое внимание было уделено гипотезе биотической устойчивости, предсказывающей, что различные сообщества должны лучше сопротивляться вторжениям. В то время как исследования природных сообществ в целом опровергают эту гипотезу, сообщая о положительной взаимосвязи между разнообразием местных видов и инвазивностью, некоторые исследования местного масштаба вместо этого получили отрицательную взаимосвязь.В большинстве трактовок этой темы не учитывалось, что все экзотические захватчики ведут себя по-разному: в то время как «слабые» захватчики становятся второстепенными компонентами сообществ, «сильные» захватчики становятся доминантами сообщества за счет местных видов. В то же время конкретное воздействие сильных захватчиков на сообщества плохо задокументировано, но имеет решающее значение для понимания последствий утраты разнообразия. Имея в виду эти недостатки, мы изучили отношения местного масштаба между местными и экзотическими таксонами растений в сообществах дерновинных трав западной Монтаны, США.Мы обнаружили, что показатели разнообразия и инвазивности аборигенных видов положительно коррелировали в сообществах с низким уровнем инвазии, где как слабые, так и сильные вселенцы встречались при низкой плотности, но отрицательно коррелировали в сообществах с высоким уровнем инвазии, где доминировал сильный вселенец Centaurea maculosa. Кроме того, как при низком, так и при высоком уровне инвазии слабые вселенцы, как правило, положительно зависели от богатства местных видов, в то время как сильные вселенцы менялись отрицательно. Слабые вселенцы определяли в целом положительные отношения между местными и экзотическими видами в сообществах с низкой инвазией и, по-видимому, сосуществовали с местными таксонами.В сообществах с высокой инвазией преобладали сильные захватчики, создавая в них негативные общие отношения. Эти негативные отношения в первую очередь отражали сильное воздействие захватчиков, что подтверждается тем фактом, что отрицательные корреляции C. maculosa с разнообразием и численностью местных видов сохранялись, когда мы статистически контролировали уровни местных видов, представляющих условия до вторжения. Кроме того, негативные ассоциации C. maculosa с местными таксонами различались по силе в зависимости от функциональной группы и вида, оказывая сильное влияние на численно доминирующие виды, что свидетельствует о резком изменении состава и структуры сообщества.Различие между слабыми и сильными захватчиками важно для согласования противоречивых результатов предыдущих исследований природных сообществ и отвлечения внимания от текущих дебатов вокруг гипотезы биотической устойчивости.

    Цитата

    Ортега, Иветт К.; Пирсон, Дин Э. 2005. Слабые и сильные захватчики естественных растительных сообществ: оценка неуязвимости и воздействия. Экологические приложения. 15(2): 651-661.

    Примечания к публикации

    • Мы рекомендуем вам также распечатать эту страницу и прикрепить ее к распечатке статьи, чтобы сохранить полную информацию о цитировании.
    • Эта статья была написана и подготовлена ​​служащими правительства США в официальное время и поэтому находится в открытом доступе.

    https://www.fs.usda.gov/treesearch/pubs/48040

    Остеохондроз (слабость ног – ОКР)

    Предыстория и история

    Травма на сегодняшний день является наиболее распространенной причиной хромоты сухостойных свиноматок с момента отъема до момента опороса. Экологическая травма области коронарного пучка и подошвы или стенки стопы приводит к проникновению в чувствительные ткани, инфицированию и хромоте. Эти состояния стопы называются кустовой ножкой и ножной гнилью. Однако травма чаще возникает косвенно из-за других причин в окружающей среде, которые создают силы сдвига на мышцах, сухожилиях, костях и костных структурах.Такие изменения, связанные с хрящевыми структурами, называют слабостью ног или остеохондрозом.

    Термин «слабость ног» также иногда используется для описания плохого строения ног или для описания клинического состояния, связанного с хромотой и тугоподвижностью. Возникает из-за аномальных изменений в суставном хряще и ростовых (эпифизарных) пластинках. Эти пластинки отвечают за рост костей как в длину, так и в диаметре.Хотя точные механизмы, вызывающие эти изменения, до конца не изучены, они возникают из-за давления и напряжения сдвига, воздействующего на эти быстрорастущие ткани.Это давление снижает поступление кислорода, вызывая аномальный рост и консистенцию хряща. Повреждение хряща имеет тенденцию быть прогрессирующим и необратимым. Поврежденный хрящ заменяется фиброзной тканью. Это повреждение хряща, в свою очередь, приводит к укорочению и искривлению костей вблизи суставов и на концах длинных костей. Слабые эпифизарные пластинки также склонны к переломам, а хрящ, покрывающий суставные поверхности, расщепляется и образует трещины. Важно понимать, что такие изменения в хрящах происходят у большинства, если не у всех современных свиней, начиная с двухмесячного возраста.В некоторых случаях многие из них можно обнаружить только под микроскопом. Интересно отметить, что такие изменения не могут быть обнаружены у дикого кабана, которому требуется до двух лет, чтобы достичь половой зрелости. Таким образом, обсессивно-компульсивное расстройство является фактом жизни в современном свиноводстве, но его тяжесть и последствия во многом зависят от окружающей среды. OCD является результатом многолетнего отбора животных на быстрый рост, большую мышечную массу и эффективную конверсию корма и, следовательно, гораздо больший вес на пластинах роста, пока они еще неполовозрелые, а также стрессы, связанные с интенсивными методами производства.Преобразование хрящей в кости включает отложение кальция и фосфора, и хотя процесс разрушения и восстановления кости продолжается на протяжении всей жизни, рост костей прекращается, когда свиноматке исполняется примерно 14–16 месяцев.

    Нередко на племенных предприятиях от 20 до 30% хряков и подсвинков выбраковываются после завершения теста продуктивности из-за слабости и деформации конечностей.

    Свиноматки с хорошим строением ног демонстрируют угловатость костей в тазобедренном, коленном и скакательном суставах.Кости ниже скакательного сустава слегка наклонены вперед, а ступни хорошо стоят на земле. Свиноматки, которые подвержены слабости ног, имеют прямые ноги с небольшим углом наклона костей между суставами, а спина имеет тенденцию быть изогнутой. Такое выравнивание увеличивает касательные напряжения на пластинах роста.

    Похожие заболевания

    Есть две, Mycoplasma hyosynoviae инфекция и рожистое воспаление. В обоих случаях заболевание обычно начинается внезапно, иногда с повышением температуры тела, болью и припухлостью суставов.Отличительной чертой является ответ на лечение. ОКР не реагирует на антибиотики, тогда как Mycoplasma hyosynoviae и рожистое воспаление реагируют в течение 24–36 часов, первые — на линкомицин или тиамулин, а вторые — на пенициллин.

    Клинические признаки

    Острое заболевание

    Наблюдается при разделении или переломе костей эпифизарной пластинки (эпифизеолиз), связанном с внезапным движением. Животное ходит на трех ногах, больная нога свободно болтается.Обычно можно почувствовать крепитацию или трение сломанных костей друг о друга. Также могут возникать внезапные переломы коленных и локтевых суставов, которые чаще встречаются у молодых растущих свиней. Переломы позвонков в позвоночнике происходят особенно во время лактации и сразу после отъема. В таких случаях свиноматка испытывает острую боль, часто находится в положении сидящей собаки с выдвинутыми далеко вперед задними ногами. Животные, содержащиеся в клетках для опороса со скользким полом, имеют тенденцию скользить задними ногами вперед, и существует риск отрыва задних мышц от их прикрепления к тазу (апофизеолиз).В таких случаях свиноматка будет стоять с посторонней помощью, но не может отвести заднюю ногу назад. Когда его кладут на землю, он просто скользит вперед. Таких животных следует немедленно убивать.

    Хроническое заболевание

    Начало постепенное. Свинья демонстрирует аномальное строение ног и походку с скованностью и болью или без них. Температура остается нормальной, суставы не опухают, если нет переломов.

    Передние ножки

    • Они могут быть прямыми, когда свинья идет длинным шагом на носочках.
    • Колени могут быть согнуты внутрь или согнуты, что заставляет свинью ходить короткими шагами.
    • Пясти могут быть опущены. Это часто встречается у старых свиноматок из-за укороченных костей и ослабленных сухожилий.
    • Ножки можно поворачивать или скручивать.

    Задние ноги

    • Прямые, с раскачиванием бедер при движении свиньи. Избегайте выбора таких самок для разведения.
    • Ноги подвернуты под туловище.
    • Скакательные суставы повернуты внутрь и сближены.
    • Свинья ходит гусиным шагом.
    • Аналогичным образом у старых свиноматок пясти могут быть опущены.

    Аномальная походка возникает либо из-за болей в суставах, либо из-за аномальных движений задних конечностей от бедер, которые создают раскачивающиеся движения. Боль связана с повреждением чувствительных мембран вокруг суставов в результате расщепления или эрозии хряща в суставах или движения пластин роста. У некоторых свиней, однако, могут проявляться серьезные клинические признаки, но при патологоанатомическом исследовании суставы выглядят нормальными, и наоборот.Могут воспаляться суставы (артрит), особенно тазобедренные, коленные и локтевые. ОКР можно наблюдать в течение трех месяцев после поступления свинок на ферму, во время их первой беременности, лактации или в первые 2-3 недели после отъема.

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.