Сульфатация организма человека: Витамины и микроэлементы, участвующие в регуляции детоксикационной системы печени (Fe, Mg, Mo, Zn, S, витамины A, C, B1, B3, B5, B6, B9, B12)

Содержание

Есть ли вред аккумуляторов для здоровья человека?

Категория: Поддержка по аккумуляторным батареям
Опубликовано 22.06.2016 13:10
Автор: Abramova Olesya


При корректной эксплуатации электрические батареи безопасны, но необходимо соблюдать осторожность при контакте с поврежденными элементами и также при работе со свинцово-кислотными аккумуляторами, в которых открыт доступ к свинцу и серной кислоте. Некоторые страны маркируют свинцово-кислотные аккумуляторы как вмещающие опасные вещества, и такой подход не лишен оснований. Свинец может быть опасен для здоровья, если не будет должным образом обработан.

Свинец – это токсичный металл, который может попасть в организм при вдыхании свинцовой пыли или через ротовую полость с загрязненных свинцом рук. Если произошла утечка в землю, то кислота и частицы свинца приводят к загрязнению почвы и попадают в воздух с парами воды.

Наиболее подвержены воздействию свинца дети и плоды у беременных. Чрезмерное содержание свинца может повлиять на рост ребенка, вызвать поражение головного мозга, нанести вред почкам, ухудшить слух и вызвать поведенческие проблемы. У взрослых свинец может привести к потере памяти и снизить способность к концентрации внимания, а также нанести вред репродуктивной системе. Дополнительно известно, что свинец вызывает повышенное кровяное давление, нервные расстройства, а также мышечные и суставные боли. Есть версия, что Людвиг ван Бетховен умер именно от отравления свинцом.

К 2017 году члены Международной Ассоциации по добыче свинца планируют снизить уровень этого вещества в крови работников горнодобывающей, металлургической, перерабатывающей и отрасли утилизации к уровню ниже 30 микрограммов на децилитр (30 мкг/дл). В 2014 году несмотря на то, что средний показатель уровня свинца в крови работников составил 15,6 мкг/дл, у 4,8% работников он был выше 30 мкг/дл (по материалам Batteries & Energy Storage Technology за лето 2015 года).

Серная кислота в свинцово-кислотном аккумуляторе имеет высокую коррозионную активность и является более вредной, чем кислоты, используемые в большинстве других электрохимических систем. Контакт этой кислоты с органами зрения может привести к постоянной слепоте, попадание внутрь через ротовую полость повреждает внутренние органы, что может привести к смерти. При попадании кислоты на кожу, необходимо немедленно промыть место контакта большим количеством воды в течение 10-15 минут, чтобы охладить поврежденные ткани и предотвратить вторичное повреждение. Загрязнённую одежду нужно немедленно снять. При работе с серной кислотой всегда используйте средства индивидуальной защиты.

Кадмий используется в никель-кадмиевых аккумуляторах и считается более вредным, чем свинец при попадании внутрь организма. В Японии, где находится много заводов, производящих такие аккумуляторы, рабочие испытывают проблемы со здоровьем от длительного воздействия этого металла. Правительствами многих стран были введены существенные ограничения, связанные с использованием и утилизацией никель-кадмиевых аккумуляторов. Мягкий, беловатый металл, который встречается в природе в грунтах, может привести к сильному повреждению почек. Кадмий может проникать в организм, всасываясь через кожу при контакте с аккумулятором. Но так как большинство NiCd аккумуляторов запечатанные, риск возникает при работе с поврежденными или негерметичными.

Никель-металл-гидридные батареи считаются нетоксичными, единственным проблемным моментом в плане вреда здоровью у них является электролит. Никель, хоть и токсичен для растений, для человека не вреден.

Литий-ионный аккумуляторы также считаются безвредными, но тем не менее в их составе присутствует небольшое количество токсичных веществ. При работе с поврежденным аккумулятором следует соблюдать осторожность, нельзя допускать контакта веществ с органами зрения, дыхания и ротовой полостью. После следует тщательно помыть руки.

Маленькие батарейки или аккумуляторы храните в недоступном для детей месте. Довольно много случаев, когда маленькие дети проглатывают элементы кнопочной формы, ежегодно в одних только Соединенных Штатах 2800 детей требуют медицинской помощи в связи с этой проблемой. Согласно отчету за 2015 год, количество серьезных травм и смертельных случаев от глотания батарей увеличилось в девять раз за последнее десятилетие.

Часты случаи, когда батареи застревают в пищеводе. Вода или слюна создает электрический ток, который может вызвать химическую реакцию, производящую гидроксид натрия, едкое вещество, которое вызывает серьезные ожоги окружающих тканей. Врачи нередко неправильно диагностируют такие случаи, которые проявляются лихорадкой, рвотой, плохим аппетитом и слабостью. В то же время, бывают случаи, когда батарейки проходят через весь пищеварительный тракт без особого вреда здоровью. Но в любом случае, родитель должен выбирать для ребенка безопасные игрушки и держать батарейки подальше.

4. Советы безопасности
  • Храните батарейки в недоступном для детей месте. Помните, что пульты дистанционного управления, музыкальные поздравительные открытки, часы, слуховые аппараты, электронные термометры, игрушки и много других вещей содержат небольшие электрохимические элементы питания, которые могут быть проглочены детьми.

  • Также как и лекарства, запасные батарейки должны быть заперты для предотвращения доступа к ним маленьких детей.

  • Поговорите с детьми об опасности проглатывания батареек, также поделитесь этой информацией с воспитателями, членами семьи, друзьями.

  • Если у вас есть причины подозревать, что ваш ребенок проглотил батарейку, то немедленно обратитесь за медицинской помощью. Не следует пить воду и принимать пищу до медицинского обследования.

5. Вентиляция

Зарядка аккумуляторов в жилых помещениях должна быть безопасной, в большей мере это относится к свинцово-кислотной электрохимической системе. Помещению, где происходит зарядка, необходимо обеспечить достаточное проветривание. Свинцово-кислотные аккумуляторы при зарядке производят некоторое количество водорода, которое минимально при правильной зарядке. Но уже при 4% концентрации водорода в воздухе эта смесь становится взрывоопасной.

Такая ситуация с накоплением водорода может произойти при зарядке большого аккумулятора в непроветриваемом и невентилируемом помещении.

Излишняя перезарядка свинцово-кислотного аккумулятора может привести к образованию сероводорода. Этот бесцветный газ очень ядовит, горюч и имеет запах тухлых яиц. Сероводород может образовываться естественным образом при распаде органических веществ в болотах или канализационных коллекторах, он присутствует в составе вулканического и природного газов, а также может быть растворенным в некоторых водах. Будучи тяжелее воздуха, сероводород накапливается в нижней части плохо вентилируемых помещений. Несмотря на специфический запах, со временем обоняние человека притупляется, и потенциальная жертва может вовсе и не догадываться о присутствии газа.

Самый дельный совет при обнаружении запаха сероводорода — выключите зарядное устройство, обеспечьте помещению проветривание и оставайтесь снаружи, пока запах не исчезнет.

Осторожно!

Следует помнить о необходимости ограничения зарядных токов при работе с литиевыми батареями. Всегда устанавливайте предел тока к самому низкому практическому уровню и следите за напряжением и температурой аккумулятора. В случае разрыва, утечки электролита или при любом другом случае воздействия электролита, немедленно промойте место поражения водой. При попадании электролита в глаза, промывайте их в течение 15 минут и немедленно обратитесь к врачу.
Используйте защитные перчатки для работы с электролитом, свинцом и кадмием.

Последнее обновление 2016-05-25

Лечение холестатических заболеваний печени при беременности с помощью УДХК

Скачать публикацию

Журнал «Рецепт» № 3 (65), 2009

В.М. Циркунов — д.м.н., профессор, зав.каф. инфекционных болезней Гродненского государственного медицинского университета

Заболевания печени в период беременности разделяют на 2 группы: болезни, ассоциированные с беременностью, самостоятельные, на фоне которых возникает беременность, и болезни, которые отмечаются только при беременности и беременностью обусловлены [5, 7]. Как в одном, так и в другом случае доминирующим патогенетическим механизмом поражения печени является синдром холестаза [12,36].
Холестаз представляет собой полную или частичную остановку или супрессию выделения желчи. Это может произойти внутри гепатоцитов, в билиарных канальцах или же в системе желчных протоков (внутри- или внепеченочных). Среди заболеваний, сопровождающихся холестазом различной степени выраженности, у беременных могут встречаться:

■ первичный билиарный цирроз (ПБЦ),
■ первичный склерозирующий холангит (ПСХ),
■ аутоиммунный гепатит,

■ вирусный гепатит,
■ внутрипеченочный холестаз беременных (ВПХ),
■ неалкогольный стеатогепатит,
■ лекарственный холестаз,
■ камни желчных протоков.

Частота развития приведенной патологии у беременных отличается тем, что накладывает отпечаток на течение и исходы беременности. Из обследованных нами 116 беременных женщин с различной патологией печени и желчного пузыря, у 40 (34,5%) диагностирован ВХБ, у 30 (25,9%) — персистирование HBsAg и анти-HCV, хронический вирусный гепатит имел место у 28 (24,1%) женщин, у 18 (15,5%) — желчнокаменная болезнь (ЖКБ) и дискинезия желчевыводящих путей [5]. Как видно из наших данных, ВХБ был преобладающим в структуре гепатопатологии у беременных.
Внутрипеченочный холестаз беременных (ВПХ) — относительно доброкачественное заболевание, проявляющееся зудом кожи, обычно в
сочетании с умеренной холестатической желтухой. Заболевание развивается, как правило, в III триместре беременности и быстро исчезает после родов [1]. При холестазе нарушаются транспортные процессы и билиарная секреция органических анионов и неорганических ионов. Результат — ретенция (задержка) желчных кислот, билирубина и других субстанций, в норме выделяющихся с желчью. Биохимически холестаз проявляется в характерном повышении уровня таких печеночных ферментов, как щелочная фосфатаза (ЩФ) и у-глютамилтранспептидаза (Г-ГТП). Основными клиническими признаками холестаза являются кожный зуд, желтуха, темная окраска мочи и обесцвеченный (ахоличный) кал.

Основная цель лечения ВХБ — улучшение самочувствия матери, уменьшение кожного зуда и снижение уровня желчных кислот в сыворотке крови, которые могут оказать патологическое воздействие на организм плода.
Из немедикаментозных мер для снижения зуда рекомендуется отдых, умеренное употребление жиров.
Для подавления зуда назначаются антигистаминные препараты, бензодиазепины, малые транквилизаторы. Они подавляют зуд, однако не оказывают действия на биохимические показатели крови, состояние плода и роды [7,9, 36]. Кроме того, данный вид препаратов сам по себе способен вызвать поражение печени и усилить как холестаз, так и цитолиз [7].
Для лечения ВХБ назначается фенобарбитал, производные никотиновой кислоты [7, 9]. Малые дозы фенобарбитала и диэтилникотинамиды способствуют активизации микросомальных ферментов, что приводит к снижению синтеза желчных кислот [9,38]. В нескольких исследованиях беременные женщины, больные ВХБ, получали лечение этим препаратом. У 50% пациенток зуд снизился, однако это лечение не оказало воздействия на обмен желчных кислот [9].
Имеются сообщения о лечении ВХБ беременных дексаметазоном, который подавляет выработку эстрогенов плацентой [14]. Однако установлено, что дексаметазон не приводил к улучшению состояния больных, в связи с чем дальнейшие исследования не проводились [9].
Известным абсорбентом желчных кислот является холестирамин. Препарат объединяет желчные кислоты и способствует увеличению их выделения вместе с калом. Доказано, что холестирамин у многих беременных снижает интенсивность зуда [31]. В то же время было показано, что в результате применения холестирамина и улучшения биохимических показателей у многих беременных, принимавших холестирамин, возникала стеаторея. Причиной этого было ухудшение усвоения в кишечнике жирорастворимых витаминов, в особенности витамина К, что, в свою очередь, дополнительно вызывало нарушение свертываемости крови [31, 36]. В литературе описано несколько случаев острых интракраниальных геморрагии у плода, которые наблюдались при лечении беременных холестирамином [39]. В связи с возможным развитием коагулопатий, в случае длительного приема препарата необходимо дополнительно назначать витамин К и осуществлять мониторинг показателей свертываемости крови [9].
 На сегодняшний день самым эффективным методом лечения ВХБ является гидрофильная урсодезоксихолиевая кислота (УДХК), в частности, препаратами Холудексан, Урсофальк, Урсосан. В последнее время для лечения ВХБ в Беларуси успешно применяется препарат — Холудексан 300 мг, («World Medicine»). УДХК по своей молекулярной структуре сходна с хенодезоксихолевой кислотой, но имеет при этом одно небольшое, однако очень существенное отличие: гидроксильная группа в молекуле ХДХК присоединена в положении 7-а, а в молекуле УДХК — в положении 7-р. ХДХК, благодаря одновременному наличию в ее молекуле гидрофильных и липофильных структур, обладает способностью образовывать в воде агрегаты (так называемые мицеллы), имеющие полярную поверхность и неполярное (аполярное) ядро. Взаимодействуя с гидрофобными молекулами клеточных мембран гепатоцитов, эти мицеллы могут оказывать выраженное цитотоксическое действие, вызывая в конечном итоге повреждения клеточных мембран гепатоцитов вплоть до развития цитолиза. УДХК в противоположность ХДХК проявляет гидрофильные свойства (полярная структура) при практически полном отсутствии липофильных свойств.
Фармакокинетика УДХК. Капсулы УДХК содержат кристаллы в кислотной форме, слаборастворимые при рН<7,0. После перорального применения в терапевтической дозе (10-15 мг/кг в сутки) УДХК абсорбируется в основном в тонком кишечнике и в небольшой степени — в ободочной кишке [21, 33]. У пациентов с холестазом и пониженной билиарной секрецией эндогенных желчных кислот абсорбция УДХК может быть снижена. При приеме внутрь УДХК поступает в печень по системе воротной вены (первоначальный захват составляет около 50%), в печени УДХК конъюгируется в основном с глицином, в меньшей степени — с таурином, и активно секретируется в желчь. Считают, что фармакологические эффекты УДХК при холестатических заболеваниях обусловлены именно ее конъюгатами. Однако, учитывая то, что даже при холестазе процессы конъюгации в печени протекают чрезвычайно эффективно, назначение препарата в неконъюгированной форме является достаточным.
Конъюгаты УДХК абсорбируются в основном в дистальном отделе подвздошной кишки, где они конкурируют с эндогенными желчными конъюгатами в отношении активного транспорта и включаются в кишечно-печеночную циркуляцию. Неабсорбированные конъюгаты УДХК продвигаются в ободочную кишку, подвергаются деконъюгации и преобразуются с участием кишечных бактерий в литохолевую кислоту. Вследствие низкой растворимости в воде основное количество литохолевой кислоты остается в кишечном содержимом в нерастворенном виде. Часть литохолевой кислоты возвращается в печень и подвергается сульфатации, которая, в свою очередь, приводит к экскреции с фекалиями [33].
Механизмы действия УДХК многообразны и пока окончательно не изучены. Сгруппировать их можно следующим образом.

Холеретический эффект:
■ вытеснение пула токсических гидрофобных желчных кислот за счет конкурентного захвата рецепторами в подвздошной кишке;
■ стимуляция экзоцитоза в гепатоцитах путем активации Са-зависимой а-протеинкиназы ведет к уменьшению концентрации гидрофобных желчных кислот;
■  индукция бикарбонатного холереза усиливает выведение гидрофобных желчных кислот в кишечник.
При всех видах холестаза нарушается образование желчи, вследствие чего происходит задержка желчных кислот и других потенциально токсических компонентов желчи в печени, что приводит к повреждению клеток печени, последующему усугублению нарушений образования желчи и гепатоцеллюлярному апоптозу. По результатам экспериментальных исследований установлено, что УДХК стимулирует билиарную секрецию желчных кислот и других органических анионов (например, глюкуронидов билирубина, конъюгатов глютатиона) и предотвращает индуцированный гидрофобными желчными кислотами холестаз в печени крыс [13,23]. Эти данные соответствуют результатам клинических исследований, согласно которым лечение УДХК стимулирует билиарную секрецию желчных кислот у пациентов с ПБЦ и ПСХ [22], а также приводит у этих больных к снижению уровня билирубина в сыворотке крови [27,34]. Таким образом, благоприятные эффекты УДХК при холестазе могут быть связаны с усилением элиминации токсических компонентов из гепатоцитов [33].
Секреторная способность гепатоцитов определяется значительным количеством и активностью белков-переносчиков в апикальной мембране и может регулироваться на транскрипционном и посттранскрипционном уровне. Результаты исследований свидетельствуют о том, что УДХК стимулирует экспрессию транспортных белков, необходимых для билиарной секреции в гепатоците [16], а также продвижение и включение транспортных молекул в канальцевую мембрану [13, 25]. Осуществляя повышающую регуляцию синтеза, апикального включения и активации транспортных белков, выводящих из клетки желчные соли и конъюгаты, УДХК может усиливать ток желчи, зависимый и независимый от желчных солей [33].

Цитопротективный эффект. Встраивание УДХК в фосфолипидный слой клеточной мембраны ведет к стабилизации последней и повышению устойчивости к повреждающим факторам. В исследованиях in vitro гидрофобные желчные кислоты вызывали повреждения мембран клеток при концентрациях от высоких микромолярных до миллимолярных. Конъюгаты УДХК противодействуют влиянию гидрофобных желчных кислот [18, 20]. Считают, что мембраностабилизирующий эффект УДХК обусловлен способностью препарата модулировать структуру и состав богатых фосфолипидами смешанных мицелл в желчи [20,33]. Поскольку высокая концентрация желчных кислот отмечается только в просвете желчных путей, представляется, что значимость этих исследований in vitro ограничена билиарным деревом. Фосфолипиды желчи участвуют в защите мембран холангиоцитов от повреждения гидрофобными желчными кислотами путем образования смешанных с желчными кислотами мицелл. У мышей со сниженной способностью к секреции в желчь фосфолипидов развивается хронический негнойный холангит, подобный таковому при хронических холестатических заболеваниях печени человека [40]. Насыщение желчи УДХК делает желчь более гидрофильной и менее цитотоксичной. При кормлении животных УДХК уменьшалась выраженность холангиоцеллюлярного повреждения, воспаления портальных трактов и пролиферация дуктул [40]. Подобным же образом у пациентов с ПБЦ и ПСХ при лечении УДХК отмечали уменьшение выраженности перидуктальной воспалительной реакции [19, 32, 34]. Эффекты УДХК в отношении холангиоцитов, очевидно, были связаны с Са+- и протеинкиназа С-а (РКСа)-зависимыми механизмами. Ранее было установлено, что Са+- и РКСа-зависимые механизмы вносят вклад в антихолестатическое действие конъюгатов УДХК в гепатоцитах [13]. Таким образом, есть все основания предполагать, что конъюгаты УДХК могут защищать холангиоциты от повреждающего влияния желчных кислот путем стимуляции базолатеральной секреции и снижения холангиоцел-люлярной концентрации гидрофобных желчных кислот [33].

Антиапоптотический эффект. Снижение концентрации ионизированного Са в клетках, ведущее к предотвращению выхода цитохро-ма С из митохондрий, блокирует, в свою очередь, активацию каспаз и апоптоз холангиоцитов. При холестатических заболеваниях печени, таких, как ПБЦ, апоптоз является основным видом гибели гепатоцитов. Его возникновение связывают с действием гидрофобных желчных кислот, накапливающихся в клетках печени при холестазе [26]. В гепатоцитах крысы гликохенодеоксихолевая кислота вызывла апоптоз путем лиганд-независимой активации рецептора смерти Fas, что приводило к последующей активации каспазы 8 и проапоптической молекулы Bid. Известно, что Bid сопровождает другую проапоптическую молекулу Вах к митохондриальной мембране. Таким образом, возникает изменение проницаемости митохондриальной мембраны, которое заключается во внезапном повышении проницаемости внутренней мембраны митохондрий для ионов. В дальнейшем происходит набухание митохондрий, высвобождение цитохрома С в цитозоль, взаимодействие цитохрома С с активирующим протеазы апоптотическим фактором I, затем — активация каспазы 9 и апоптическая гибель клетки [26]. Антиапоптические эффекты УДХК были выявлены в исследованиях in vitro и in vivo на крысах [11, 37]. Эти эффекты были связаны со снижением проницаемости митохондриальной мембраны, уменьшением высвобождения митохондриального цитохрома С [26, 37]. Установлено, что УДХК посредством активации рецепторов эпидермального фактора роста вызывает в гепатоцитах сигналы, направленные на выживание клетки, обуславливая, таким образом, антиапоптический эффект [35].

Иммуномодулирующий эффект УДХК заключается в уменьшении экспрессии молекул HLA I класса на гепатоцитах и HLA II класса на хо-лангиоцитах, снижении продукции провоспалительных цитокинов [1].

Гипохолестеринемический эффект УДХК обусловлен снижением синтеза холестерина в желчь, уменьшением кишечной абсорбции холестерина и стимуляцией выхода холестерина из камней в желчь. УДХК оказывает также умеренный подавляющий эффект на синтез холестерина в печени, тормозя ГМК-КоА-редуктазу [1].

Литолитический эффект УДХК связан со снижением литогенности желчи вследствие формирования жидких кристаллов с молекулами холестерина, предупреждением образования и растворение холестериновых камней.

Антифибротический эффект УДХК, установленный на экспериментальных моделях, заключается в ингибирующем эффекте препарата на пролиферативную активность человеческих фибробластов, стимулированную фактором роста тромбоцитарного происхождения.

Антиоксидантные свойства УДХК, описанные в литературе, обусловлены изменением метаболизма простагландинов и жирных кислот, их влиянием на регенерацию печени через систему цитокинов.

К сожалению, недостаточно данных об эмбриотоксическом действии УДХК, полученных в эксперименте на животных. Тератогенное действие (порок развития хвоста) наблюдалось у крыс после дозы в 2 г/кг в день. Это чрезвычайно высокая доза соответствует дозе УДХК, почти в 100 раз превышающей терапевтическую дозу в 12-13 мг/кг, рекомендуемую больным людям. В то же время у кроликов доза 300 мг/кг в день не вызывала тератогенного эффекта [3].
ВПХ беременных ассоциирован с рядом осложнений для матери — увеличением послеродовых кровотечений вследствие сниженной абсорбции витамина К, увеличением риска ЖКБ при последующих беременностях [4]. В то же время при отсутствии лечения риск антенатальной гибели плода и преждевременных родов, а также перинатальная смертность возрастают. Считается, что неблагоприятный прогноз для плода обусловлен тем, что возрастающая концентрация гидрофобных желчных кислот в организме матери приводит к повышению их уровня у плода. Поскольку при ВПХ имеет место нарушение функции плацентарного барьера, гидрофобные желчные кислоты (в повышенной концентрации) не могут быть полностью возвращены 8 систему кровообращения матери. Повышение концентрации солей желчных кислот ведет к более частым сокращениям матки и сужению кровеносных сосудов плаценты. Хорошо известное токсическое действие неконъюгированного билирубина на ЦНС можно экстраполировать и на хенодезоксихолевую кислоту, обладающую гидрофобным действием и потому потенциально токсичную [3].
Лечение УДХК (Холудексан 300 мг) ведет к изменению индивидуального спектра желчных кислот: содержание УДХК повышается до 50% от общего содержания желчных кислот в сыворотке, при этом пропорция других желчных кислот соответственно меняется в сторону уменьшения.
В клинических исследованиях была доказана эффективность препарата в дозе 8-10 мг/кг/сутки у пациенток с ВПХ беременных [24]. В проспективное открытое одноцентровое исследование, проведенное в Каунасском медицинском университете в 1999 -2002 гг., было включено 84 беременных женщины (возраст от 18 до 41 года) с симптомами кожного зуда, возникшем во 2-3 триместре, и наличием по крайней мере одного повышенного биохимического показателя (АлАТ>45 Е/л, АсАТ>40 Е/л, желчных кислот (ЖК) натощак >10 мкмоль/л). Участницы были рандомизированы на получение УДХК (8-10 мг/кг в сутки) или холестирамина (8 г/сутки) в течение 14 дней.
Исследования показали, что уменьшение интенсивности зуда более чем на 50% отмечено в 67% случаев, а также нормализация биохимических показателей холестаза. Терапия УДХК привела к достоверному уменьшению активности АлАТ, АсАТ, уровня желчных кислот при отсутствии изменений содержания билирубина и ЩФ.
Лечение холестирамином, напротив, не изменило активности трансаминаз, уровня ЖК при достоверном повышении содержания билирубина и ЩФ. Хотя не было зарегистрировано ни одного случая мертворождения и не отмечено различий в весе новорожденных, оценка по шкале Апгар на 5 минуте была значительно выше в группе, получавшей УДХК, чем в группе женщин, принимающих холестирамин. В данном исследовании относительно краткосрочное использование умеренных доз УДХК значительно снизило симптомы кожного зуда, уменьшило активность трансаминаз и концентрацию ЖК, сопровождалось лучшими исходами беременности при отсутствии каких-либо побочных реакций. Напротив, терапия холестирамином только умеренно купировала симптомы зуда и часто вызывала побочные реакции [24].
Эффективность терапии УДХК подробно изучена у больных ПБЦ, который служит моделью хронических холестатических заболеваний печени. У таких больных ежедневный прием УДХК в дозе 13-14 мг/кг/ сутки эффективно снижает уровень билирубина в сыворотке крови (важнейший прогностический критерий при ПБЦ), уровень ЩФ и печеночных трансаминаз, замедляет (приостанавливает) развитие цирроза, варикозного расширения вен пищевода, повышает выживаемость пациентов без трансплантации печени [3,4].
Данные о терапевтическом применении ЖК во время беременности у женщин, страдающих ПБЦ, носят единичный характер. Приводятся сведения об одной больной, получавшей лечение УДХК в первом и втором триместрах. В описанном случае отмена УДХК привела к немедленному ухудшению лабораторных данных и симптоматики, в результате чего лечение УДХК было возобновлено [3].
Все рандомизированные клинические исследования, касающиеся лечения ВХБ, как правило, охватывали небольшое число больных. В систематический Кокрановский обзор, опубликованный в 2001 году, в котором, наряду с УДХК, оценивалась эффективность других лекарственных препаратов в лечении ВХБ [4], были включены 3 рандомизированных клинических исследования. Эффективность лечения УДХК сравнивали с плацебо. Общее число больных составило 56 человек, доза — 15 мг/кг/ сутки, длительность лечения — 3 недели. В одном из исследований показано положительное влияние на зуд и снижение содержания в крови ЖК и печеночных энзимов. В отношении предупреждения осложнений — снижение частоты преждевременных родов было показано только в одном исследовании. Установлена безопасность применения УДХК для матери и плода [1,4].
Исследования показали, что применение УДХК безопасно для матери, но практически нет данных о метаболизме желчных кислот у плода. Апробирована стратегия использования высоких доз УДХК с целью быстрейшей аккумуляции кислоты в желчи (дневная абсорбция препарата около 30% от назначаемой дозы) и уменьшения времени для достижения терапевтического эффекта. Обследовано 20 пациенток с ВХБ, получавших высокие дозы УДХК (1,5-2 г/сут.) под контролем показателей ЖК в сыворотке крови матери, в амниотической жидкости, сыворотке крови, взятой из пуповины после рождения [29]. Исследования показали, что даже высокие дозы препарата нетоксичны как для матери, так и для плода. Повышенные дозы препарата не только уменьшали зуд у большинства пациенток и стабилизировали биохимические показатели холестаза, но также улучшали показатели послеродового периода. Выявлено, что лечение высокими дозами УДХК приводило к снижению содержания холевой и хенодезоксихолевой кислот в амниотической жидкости [29]. Этот результат, по мнению авторов, является вторичным, вследствие уменьшения содержания токсичных желчных кислот у матери. Снижение содержания токсичных желчных кислот в материнском кровотоке приводило к терапевтическому эффекту у плода. Известно, что аккумуляция УДХК в амниотической жидкости и пуповинной крови чрезвычайно мала, так как диффузия третичной желчной кислоты через плаценту низкая. Низкая абсорбция УДХК энтероцитами плода может способствовать накоплению кислоты в меконии. Показано, что высокие уровни токсических желчных кислот отрицательно воздействуют на сердечную проводимость у плода [29].
Таким образом, лечение заболеваний печени у женщин во время беременности представляет определенные трудности, поэтому появление в арсенале акушеров-гинекологов препарата УДХК — Холудексана 300 мг («World Medicine») для устранения ВХБ является существенным достижением современной фармакотерапии и гепатологии.

■ ЛИТЕРАТУРА
1. Буеверов А.О. Возможности клинического применения урсодезоксихолевой кислоты. //Consilium Medicum. -2005. — Т. 7. — № б. — С. 460-463.
2. Липина Е.А. Урсодеоксихолевая кислота в терапии заболеваний печени, ассоциированных с холестазом, во время беременности. // Сибирский медицинский журнал. -2004. — № 5. —
С. 122-125.
3. Лукашик СП. О механизмах антиапоптотического действия урсодезоксихолевой кислоты. // Рецепт. — 2006. — № 6. — С.95-97.
4. Надинская М.Ю. Исследование применения урсодеоксихолевой кислоты в гепатологиис позиции медицины, основанной на научных доказательствах.// Consilium Medicum. -2003. — Т. 5. — № 6. — С. 318-322.
5. Негода В.В. К вопросу о синдроме внутрипеченочного холестаза у беременных. //Лечащий врач. — 2003. — № 6. — С. 58-61.
6. Хворик Н.В. Гепатологические (инфекционные и неинфекционные) причины отягощения беременности и родов. / Современные проблемы инфекционной патологии человека: сборник научных трудов — Минск, 2008. — С. 213-217.
7. Цыркунов В.М. Кордиамин — активатор процессов детоксикации: экспериментальное обоснование и первые клинические результаты. // Нижегородский медицинский журнал. -1991.-№3.-С. 50-55.
8. Шептулин А.А. Новые возможности применения урсодезоксихолевой кислоты в гастроэнтерологии // Клиническая медицина. — 1996. — № 4. — С. 8-10.
9. Шумскене Й. Гепатологические и акушерские аспекты внутрипеченочного холестаза беременных. // Гастробюллетень. — 2001. — №1. — С. 12-14.
10. Angulo P. Use of ursodeoxycholic acid in patients with liver disease. / P. Angulo — Curr.Gastroenterol., 2002, — 4: 37-44.
11. Benz C. Effects of tauroursodesoxycholic acid on bile-acid-induced apoptosis and cytolisis in rat hepatocytes. / C. Benz, S. Angermuller, U. Tox, P. Kloters-Plachky, H.D. Riedel, P. Sauer, W. Stremmel, — J. Hepatol., 1998. -28: 99-106.
12. Bercane N. Ursodeoxycholic acid in intrahepatic cholestasis of pregnancy. / N. Bercane,J.J. Cocheton, P. Merviel, С Wolf, G. Lefevre, S. Uzan, — Acta Obstet. Gynecol. Scand., 2000. -79: 941-946.
13. Beuers U. Tauroursodeoxycholic acid inserts the apical conjugate export pump, Mrp 2, into canalicular membranes and stimulates organic anion secretion by protein kinase С dependent mechanismsin cholestatic rat liver. / U. Beuers, M. Bilzer, A. Chittatu, G.A. Kullak-Ublick, D. Keppler, G. Paumgartner, F. Dombrowski, — Hepatol., 2001. — 33:1206-1216.
14. Davidson K.M. Intrahepatic cholestasis of pregnancy. / K.M. Davidson — Semin. Perinatol., 1998. — Vol. 22. — P. 104-111 .Reyes, H. /The spectrum of liver and gastrointestinal disease seen in cholestasis of pregnancy / H. Reyes — Gastroenterol., 1992. -Vol. 21. — P. 905-921.
15. Faubion W. Toxic bile salts induce rodent hepatocyte apoptosis via direct activation of Fas. /W. Faubion, M. Guicciardi, H. Miyoshi, S. Bronk, P. Roberts, P. Sringen, S. Kaufmann — J. Clin. Invest.,1999.-103:137-145.
16. Fickert P. Effects of ursodeoxycholic and cholic acid feeding on hepatocellular transporter expression in mouse liver. / P. Fickert, G. Zollner, A. Fuchsbichler, С Stumptner, C. Pojer, R. Zenz, F. Lammert- Gastroenterol., 2001.- 121:170-183.
17. Floreani A. S-adenosylmethionin versus ursodeoxycholic acid in the treatment of intrahepatic cholestasis of pregnancy: preliminary results controlled trial. / A. Floreani, D. Paternoster, A. Melis, P.V. Grella — Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 1996. — 67:109-113.
18. Guldutuna S. Molecular aspects of membrane stabilization by ursodeoxycholate. / S. Guldutuna,G. Zimmer, M. Imhof, S. Bhatti, T. You — Gastroenterol., 1993. — 104:1736-1744.
19. Heathcote   E.J. The  Canadian   multicenter  double-blind   randomized   controlled   trial   of ursodeoxycholic acid in primary biliary cirrhosis. / E.J. Heathcote, K. Cauch-Dudek, V. Walker, R.J. Bailey, LM. Blendis, C.N. Ghent, P. Michleletti, — Hepatol., 1994. — 19:1149-1156.
20. Heuman D.M. Absorption of mixtures of bile salt taurine conjugates to lecithin — cholesterol membranes: implications for bile salttoxicity and cytoprotection. / D.M. Heuman, R.S. Bajaj, Q. Lin — J. Lipid Res., 1996. — 37:562-573.
21. Hoffmann A. Pharmacology of ursodeoxycholic acid an enterohepatic drug. / A. Hoffmann -Scand. J. Gastroenterol., 1994. — 29:1 -15.
22. Jazrawi R.P. Kinetics of hepatic bile acid handling in cholestatic liver disease: effect of ursodeoxycholic acid. / R.P. Jazrawi, J.S. de Caestecker, P.M. Goggin, A.J. Britten, A.E. Joseph, J.D.Maxwell, T.C. Northfield — Gastroenterol., 1994.-106:134-142.
23. Kitani K.Tauroursodeoxycholate prevents biliary protein excretion induced by other bile salts in the rat. / K. Kitani, M. Ohta, S. Kanai — Am. J. Physiol., 1993. — 248: G. 407-417.
24. Kondrackiene J. Efficacy and safety of ursodeoxycholic acid versus cholestyramine in intrahepatic cholestasis of pregnancy. / J. Kondrackiene, U. Beuers, L. Kupcinskas, — Gastroent., 2005. — Mar.-129: 894-901.
25. Kurz A.K. Tauroursodesoxycholate — induced choleresis involves p38 (МАРК) activation and translocation of the bile salt export pump in rats. / A.K. Kurz, D. Graf, M. Schmitt, S. Van Dahl, D. Haussinger — Gastroenterol., 2001. — 121:407-419.
26. Lazaridis K.N. Ursodeoxycholic acid «mechanisms of action and clinical use in hepatobiliary disorders». / K.N. Lazaridis, G.J. Gores, K.D. Lindor — J. Hepatol., 2001. — 35:134-146.
27. Lindor K. D. Ursodeoxycholic acid in the treatment of primary biliary cirrhosis. / K.D. Lindor -Gastroenterol., 1997. — 106:1284-1290.
28. Mazzella G. Management of intrahepatic cholestasis of pregnancy. / G. Mazzella, N. Rizzo, F. Azzaroli, A. Salzetta, R. lampieri, L Bovicelli, E. Roda — Lancet, 1991. — 338:1594-1595.
29. Mazzella G. Ursodeoxycholic acid administration in patients with cholestasis of pregnancy: effects on primary bile acids in babies and mothers. / G. Mazzella, R. Nicola, A. Francesco,
S. Patrizia, B. Luciano, M. Anna, S. Giuliana, C. Antonio, N. Giovanni, M. Constance, F. Davide, R. Enrico — Hepatol., 2001. — Mar. — 33:504-508.
30. NicastriP.L.Randomizedplacebo-controlledtrialofursodeoxycholicacidandS-adenosylmethionin in the treatment of intrahepatic cholestasis of pregnancy. / P.L Nicastri, A. Diaferia, M. Tartagni, P. Loizzi, M. Fanelli — Br. J. Obstet. Gynecol., 1998. — 105:1205-1207.
31. Palma J. Effects of ursodeoxycholic acid in patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy. / J. Palma, H. Reyes, J. Ribalta — Hepatol., 1992. — Vol. 15. — P. 1043-1047.
32. Pares A. Long-term effects of ursodeoxycholic acid in primary biliary cirrhosis: results of a double-blind randomized controlled multicenteric trial. / A. Pares, L. Caballeria, J. Rodes, M. Bruguera, L Rodrigo, A. Garcia-Plaza, J. Berenguer — J. Hepatol., 2000. — 32:561-566.
33. Paumgartner G. Ursodeoxycholic acid in cholestasis liver disease: mechanisms of action and therapeutic use revisited. — Hepatol., 2002.- 36:525-531.
34. Poupon R.E. A multicenter, controlled trial of ursodiol for the treatment of primary biliary cirrhosis. / R.E. Poupon, B. Balkau, E. Eschwege, R. Poupon — UDCA-PBC Study group. N. Engl. J. Med., 1991. — 324:1548-1554.
35. Qiao L. Inhibition of the МАРК and P13K pathways enhances UDCA — induced apoptosis in primary rodent hepatocytes. / L. Qiao, A. Yacoub, E. Studer, S. Gupta, X.Y. Pei, S. Grant — Hepatol., 2002. — 35: 779-789.
36. Reyes H.The spectrum of liver and gastrointestinal disease seen in cholestasis of pregnancy. / H. Reyes — Gastroenterol., 1992. -Vol. 21. — P. 905-921.
37. Rodrigues С Ursodeoxycholic acid may inhibit deoxycholic acid — induced apoptosis by modulating mitochondrial transmembrane potential and reactive oxygen species production. /С Rodrigues, G. Fan, P. Wang, B. Kren, С Steer — Mol. Med., 1998. — 4:165-178.
38. Roncaglia T. Intrahepatic cholestasis of pregnancy: incidence, clinical course, complications. / T. Roncaglia, D.Trio, L. Roffi — Ann. Obstet. Gynecol. Med. Perinat, 1991. — Vol. 112. — P. 146-151.
39. Sadler L. Severe fetal intracranial hemorrhage treatment with cholestyramine for intrahepaticcholestasis of pregnancy. / L Sadler, M. Lane, R. North — Br. J. Obstet. Gynecol., 1995. — Vol. 102. — P. 169-170.
40. Van Nieuwkerk CM. Effects of ursodeoxycholate and cholate feeding on liver disease in FVB mice with a disrupted mdr2 8-glycoprotein gene. / CM. Van Nieuwkerk, R.P. Elferink, A.K. Groen,
R. Ottenhoff, G.N.Tytgat, K.P. Dingemans, M.A. Van Den Bergh Weerman — Gastroenterol. , 1996. 111:165-171.

Анализ биохимического ответа живых систем вчера, сегодня, завтра Глава 2

галактозой. Мед, древесные фрукты, ягоды, дыни и некоторые корнеплоды, такие как свекла,

сладкий картофель, пастернак и лук, содержат фруктозу, обычно в сочетании с сахарозой и

глюкозой. Фруктоза также образуется в результате переваривания сахарозы, дисахарида,

состоящего из глюкозы и фруктозы, который расщепляется ферментами во время

переваривания. Фруктоза — это самый сладкий сахар, встречающийся в природе, который, по

оценкам, вдвое сладче сахарозы. Он используется в качестве консерванта и внутривенного

вливания при парентеральном питании. Фруктоза является восстанавливающим сахаром, как

и все моносахариды. Самопроизвольное добавление отдельных молекул сахара к белкам,

известное как гликирование, является серьезной причиной повреждения у диабетиков. В

этом отношении фруктоза, по-видимому, так же опасна, как и глюкоза, и, следовательно, не

является ответом на диабет (McPherson et al, 1988). Это может быть важным вкладом в

старение и многие возрастные хронические заболевания (Levi & Werman 1998).

D-манноза — это углевод. Было показано, что олигосахариды с высоким содержанием

маннозы играют важную роль в контроле качества белка. Несколько внутриклеточных

белков, таких как лектины, шапероны и гликан-обрабатывающие ферменты, участвуют в

этом процессе. К ним относятся кальнексин / кальретикулин, UDP-глюкоза: гликопротеин

глюкозилтрансфераза (UGGT), рецепторы груза (такие как VIP36 и ERGIC-53),

маннозидазоподобные белки (например, EDEM и Htm1p) и убиквитинлигаза (Fbs).

Считается, что они распознают гликаны с высоким содержанием маннозы с едва различимой

структурой. Маннозсвязывающий лектин (MBL) является важной составляющей врожденной

иммунной системы. Этот белок связывается через множество лектиновых доменов с

повторяющимися массивами сахара, которые украшают многие микробные поверхности, и

затем способен активировать систему комплемента посредством специфической протеазы,

называемой MBL-ассоциированной протеазой-2. Основной путь для образования L-фукозы в

прокариотических и эукариотических клетках — от D-маннозы путем восстановления

внутреннего окисления и последующей эпимеризации GDP-D-маннозы с получением GDP-

L-фукозы

Мио-инозитол играет важную роль как вторичный мессенджер в клетке, в форме

инозитолфосфатов. Играет важную роль в сигнальном метаболизме.

Энергетические метаболиты

Креатин — непротеиногенная аминокислота, содержащаяся в позвоночных тканях и в

моче. В мышечных тканях обычно присутствует в форме креатинфосфата. В мочу выделяется

в форме креатинина. Является переносчиком фосфатных групп в энергетическом

метаболизме в реакциях контролируемых креатинкиназой. Синтезируется в основном в

Зарядка аккумулятора автомобиля

Аккумуляторная батарея является одним из важнейших узлов автомобиля. Ее назначение — обеспечить достаточным количеством электричества бортовую сеть. Если на работающем двигателе аккумулятору помогает генератор, то запуск мотора и питание потребителей при заглушенном моторе целиком и полностью обеспечивает АКБ.

Содержание:

  1. Меры безопасности
  2. Как определить, заряжен или разряжен аккумулятор?
  3. Как правильно заряжать аккумулятор: техника безопасности
  4. Методы зарядки
  5. Сколько времени необходимо заряжать аккумулятор
  6. Каким током и напряжением следует заряжать аккумулятор автомобиля
  7. Последствия глубокого разряда, и как правильно зарядить после этого
  8. Зарядка зимой
  9. Как часто нужно заряжать аккумулятор автомобиля
  10. Нужно ли заряжать новый аккумулятор для автомобиля

Оказаться в автомобиле, который отказывается заводиться в холодную погоду неприятно, поэтому батарея требует к себе пристального внимания. Важнейшим условием стабильной работы этого прибора является своевременная зарядка аккумулятора автомобиля. В необслуживаемых батареях важно контролировать, чтобы АКБ не разряжалась ниже определенного уровня. В обслуживаемых вариантах необходимо дополнительно следить за плотностью электролита и его количеством.

Меры безопасности

Для того чтобы застраховаться от получения травм, необходимо соблюдать ряд правил.

  1. Помещение, в котором будет проходить работа, должно либо иметь приточную вентиляцию достаточной производительности, либо хорошо проветриваться. Газы, которые выделяются в процессе, токсичны, и крайне негативно влияют на организм человека. В жилых помещениях заряжать аккумулятор автомобиля не стоит.
  2. Поблизости не должно быть открытого огня. Недопустимо проведение работ или совершение других действий, приводящих к образованию искр. Выделяемые газы огнеопасны, и возгорание может привести к взрыву и другим тяжелым последствиям.
  3. Запрещается наклонять и переворачивать аккумулятор. Такие действия приводят к выливанию чрезвычайно агрессивной и токсичной жидкости наружу. Батарея должна быть установлена на ровной твердой площадке в устойчивом положении.
  4. Недопустимо применение самодельных устройств. Ошибки сборки, поломки могут привести к ожогам и другим травмам.
  5. Нельзя касаться руками клемм батареи в процессе работы.
  6. Необходимо соблюдать полярность при подключении устройства.
  7. Все работы необходимо производить в резиновых перчатках и защитных очках.

Когда аккумулятор заряжается при помощи устройства непосредственно на автомобиле, необходимо отсоединить плюсовую и минусовую клеммы. Нельзя допускать чрезмерного кипения электролита. Пополнять заряд, не снимая клеммы опасно. Кислота, выплеснувшаяся в подкапотное пространство, может повредить изоляцию проводов, резиновые и пластмассовые детали. При подключенном аккумуляторе возможно замыкание электрической цепи, что чревато возгоранием.

Как определить, заряжен или разряжен аккумулятор

По мере эксплуатации любая АКБ теряет энергию. Существует несколько способов определить состояние батареи.

  1. При помощи встроенного индикатора, которым оснащено большинство современных изделий. Роль индикатора играет поплавок в виде шарика, погруженный в электролит. Все это находится внутри прозрачной стеклянной колбы. Когда все в норме, поплавок всплывает на поверхность и отчетливо виден невооруженным взглядом. Индикатор окрашен в зеленый цвет, поэтому автолюбители ошибочно считают, что загорелась лампочка. Если индикатор не виден, аккумулятор не в оптимальном состоянии.
  2. Используя мультимер. С его помощью можно измерить напряжение на клеммах, что позволяет судить о состоянии батареи, надо зарядить аккумулятор автомобиля или нет. Если напряжение находится в пределах 12,6 – 12,8 В, можно считать батарею полностью заряженной. Напряжение ниже 10,5 В свидетельствует о полном разряде. Измерения следует проводить при отсоединенных клеммах, дабы исключить падение напряжения, вызванное работающими потребителями.
  3. С помощью нагрузочной вилки. Данный метод позволяет измерить напряжение под нагрузкой, благодаря чему можно оценить фактическую емкость АКБ. Это поможет определить, как правильно заряжать аккумулятор автомобиля. Если емкость ниже критического уровня из-за сульфатации пластин и их осыпания, обслуживать такую батарею большого смысла не имеет. Аккумулятор с низкой емкостью лучше заменить.

Если нет возможности самостоятельно провести проверку нагрузочной вилкой, есть смысл обратиться в автосервис. Большинство станций техобслуживания проверяют заряд таким оборудованием бесплатно.

Как правильно заряжать аккумулятор: техника безопасности

Предварительно необходимо удостовериться, что батарея действительно нуждается в дополнительной энергии. Когда замеры показывают, что батарея частично или полностью потеряла свои свойства, следует подготовиться к пополнению заряда. В подготовке АКБ особых сложностей нет. Необходимо соблюдать осторожность и тщательность. Попадание кислоты на кожу чревато сильными ожогами, поэтому техника безопасности должна соблюдаться неукоснительно. Последовательность действий такова:

  1. Отсоединить клеммы аккумулятора, как плюсовую, так и минусовую, тем самым отключив батарею от бортовой сети.
  2. Демонтировать прибор и поместить его в то место, где будет производиться зарядка. Во избежание перегрева очистить корпус от грязи, масла, других отложений. Заодно убедиться в отсутствии механических повреждений.
  3. Внимание! Обязательно вывернуть пластиковые крышки на каждой банке. В аккумуляторе под действием внешнего напряжения образуется избыточное количество паров электролита, что приводит к повышенному давлению газов внутри АКБ. В крайних случаях возможен взрыв батареи, со всеми вытекающими последствиями. В крышках имеются дренажные отверстия, но их производительности при бурной реакции недостаточно.
  4. Убедиться, что уровень электролита соответствует норме, иначе полноценная зарядка аккумулятора автомобиля будет недостижима. При отсутствии индикатора надо долить жидкость до положения, когда свинцовые пластины полностью закрыты, но уровень меньше нижней кромки заливного отверстия. Для точного измерения можно одним концом опустить в банку полую стеклянную трубку, так чтобы она доставала до дна. Затем зажать верхний конец и извлечь трубку. Высота столба электролита должна быть около 10 – 15 мм.
  5. Проверить плотность электролита. В продаже имеются недорогие ареометры, позволяющие довольно точно определить соотношение серной кислоты и дистиллированной воды. При отклонении от нормы довести плотность до требуемого состояния.

Методы зарядки

Зарядка аккумулятора автомобиля требует применения специального устройства. Бытующее среди автолюбителей мнение, что достаточно добавить дистиллированной воды или электролита, а там генератор сам доводит процесс до конца, не совсем верно.

Отчасти это так. Можно зарядить батарею от машины соседа, принудительно завести мотор, а генератор действительно зарядит АКБ до определенного уровня. Но для полной зарядки аккумулятора автомобиля, так чтобы к этому не приходилось часто возвращаться, необходим контроль напряжения и силы тока. Без специального устройства измерить эти параметры можно, но отрегулировать нет.

Перед автолюбителем встает задача: как правильно заряжать аккумулятор автомобиля, не повредив его. Сама процедура не представляет сложности. Достаточно подсоединить к клеммам соответствующие выводы устройства и следить за параметрами, не допуская перегрева АКБ.

Существует три метода, с помощью которых можно зарядить аккумулятор автомобиля:

  • постоянным током;
  • постоянным напряжением;
  • ускоренным комбинированным методом.

Первому присуща высокая эффективность, но необходим контроль и подстройка параметров. Второй способ осуществить легче, но батарея заряжается не более чем на 80%, процесс требует длительного времени.

Комбинированный метод наиболее предпочтителен. Он позволяет зарядить аккумулятор автомобиля практически автономно, никаких регулировок не требуется. Широкому распространению этого метода препятствует в разы более высокая стоимость специального устройства.

Зарядка постоянным током

В этом случае зарядка аккумулятора автомобиля производится постоянной силой тока, которая в 10 раз меньше емкости аккумуляторной батареи. Например, АКБ емкостью 60 А.ч желательно заряжать током не выше 6 ампер. Затем силу тока в два раза уменьшают наполовину, до 3 А, а на финишном этапе до 1,5 А.

Зарядка постоянным напряжением

Этот способ, по сути, не отличается от зарядки автомобильным генератором. Отличие в том, что устройство позволяет регулировать величину напряжения, тогда как генератор — нет.

Осуществлять ее просто. Устройство подключается к клеммам АКБ и поддерживается напряжение около 14,5 вольт. Батарея считается заряженной, если сила тока при постоянном напряжении перестала уменьшаться. Как уже указывалось, таким способом можно зарядить батарею не больше чем на 80%.

Ускоренная комбинированная зарядка

В ней совмещены преимущества двух предыдущих способов. На первом этапе пополнение заряда осуществляется постоянным напряжением. По достижении определенного уровня устройство переключается на постоянный ток. Такая последовательность позволяет полностью зарядить аккумулятор автомобиля, исключает нежелательное кипение электролита.

В случае острой необходимости таким методом можно ускоренно зарядить аккумулятор автомобиля в течение получаса, даже если он полностью разряжен. Но сократится ресурс батареи.

Каждый из способов имеет свои достоинства и недостатки. Метод постоянного тока позволяет полностью, на 100%, пополнить батарею электричеством. Чем ниже сила тока, тем полнее заряд, но увеличивается время процесса. Недостатки данного метода:

  • необходимость в стабилизации силы тока;
  • обильное выделение паров электролита;
  • нагрев АКБ.

Описанный выше ступенчатый режим, когда дважды снижается сила тока, позволяет минимизировать эти негативные моменты. Применение метода постоянного напряжения сопровождается значительным нагревом батареи из-за повышенной силы тока в начале процесса. Данный метод только частично пополняет батарею энергией.

Комбинированный метод лишен недостатков, присущих первым двум способам. В современных устройствах процесс автоматизирован. При использовании таковых исключается сильный нагрев батареи, кипение электролита, обильное выделение газов. Недостаток один — дороговизна оборудования.

Сколько времени необходимо заряжать аккумулятор

Животрепещущий вопрос для автолюбителей — как правильно заряжать аккумулятор по времени. В большинстве случаев, если батарея совсем не “убита”, с проблемой недостаточного заряда автолюбители сталкиваются при отрицательных температурах. Человек, спешащий на работу и обнаруживший, что автомобиль не заводится из-за севшего аккумулятора, старается как можно быстрее решить эту проблему. Тут применяется и прикуривание от другого автомобиля, и частичная ускоренная зарядка большими токами, лишь бы быстрее завестись. Такие действия приводят к резкому сокращению срока службы батареи. Необходимо правильно заряжать аккумулятор, соблюдая все условия. При использовании метода постоянного тока, полностью разряженная батарея, если она не имеет дефектов, приходит в соответствие с паспортными характеристиками в течение примерно 10 часов. При двухступенчатом процессе время увеличивается до 15 часов. Уменьшив силу тока, можно добиться более глубокой зарядки, но время пропорционально увеличится. Двухступенчатый процесс наиболее полно отвечает требованиям, как правильно заряжать аккумулятор. Частично разряженные батареи набирают кондиции быстрее. Критерием полной зарядки является ситуация, когда напряжение АКБ стабилизировалось на уровне 14,5 В, а сила тока при этом перестала уменьшаться. Зарядка аккумулятора автомобиля постоянным напряжением требует значительно большего времени. Продолжительность процесса составляет 20 – 25 часов. Чем выше напряжение, тем быстрее заряжается батарея. Подбирать необходимо оптимальный вариант, когда напряжение тока выше напряжения аккумуляторной батареи, но при этом не происходит чрезмерного нагрева и интенсивного кипения электролита. С другой стороны, не затрачивается чрезмерно много времени. Следует помнить, что процесс зарядки аккумулятора автомобиля нежелательно прерывать и начинать заново. Это уменьшает емкость аккумулятора и снижает ресурс.

Каким током и напряжением следует заряжать аккумулятор автомобиля

Зарядку производят при силе тока, равной десятой части емкости батареи. Для 50 А.ч соответственно 5А. Такой уровень необходимо поддерживать до тех пор, пока напряжение на клеммах аккумулятора не достигнет 14,4 – 14,6 В. Затем снижают силу тока в два раза и ждут повышения напряжения до 15 В.

Следующим этапом необходимо еще раз уменьшить силу тока в 2 раза. Через какое-то время напряжение должно достигнуть 14,5 В и перестать повышаться. С этого момента батарея считается полностью заряженной.

При зарядке постоянным напряжением его поддерживают на уровне 14,5 В. Как только сила тока стабилизируется, можно заканчивать процесс.

Последствия глубокого разряда, и как правильно зарядить после этого

Глубокий разряд оказывает губительное воздействие на АКБ. Происходит сульфатация пластин, они частично разрушаются и осыпаются. При этом падает емкость батареи, такая быстро заряжается и также быстро теряет энергию.

Лучший способ избавиться от этой проблемы — заменить аккумулятор. Но если ситуация не зашла слишком далеко, применяют переполюсовку АКБ. Для начала приводят в порядок электролит и разряжают батарею до нуля, подключив галогенную лампу.

Затем подключают устройство, но наоборот: плюс к минусу, минус к плюсу. Галогенную лампу не отсоединяют. Заряжают батарею до 5 вольт. После этого отсоединяют лампу, нормально подключают устройство и завершают процедуру в обычном порядке, как на частично разряженном аккумуляторе.

Зарядка зимой

Аккумуляторные батареи могут заряжаться при температуре окружающего воздуха от –15 до +40 ºC. Важно, чтобы плотность электролита соответствовала климатическим условиям. При понижении температуры напряжение следует увеличить, а при повышении уменьшить. Корректировочная величина — 0,03 В на 1 ºC.

Оптимальной температурой является диапазон 20–25 ºC. Поэтому в холода лучше заниматься аккумулятором в теплом помещении.

Как часто нужно заряжать аккумулятор автомобиля

Чем реже происходит зарядка внешним источником, тем долговечнее батарея, если она не разряжается ниже определенного предела. Ведь при езде эту функцию непрерывно выполняет генератор. Целесообразно проводить эту процедуру раз в год, перед наступлением холодов, и каждый раз после длительной стоянки.

Нужно ли заряжать новый аккумулятор для автомобиля

Новые аккумуляторы не нуждаются в обслуживании, если перед продажей длительное время не стояли на складе. Батарея имеет свойство медленно терять напряжение за счет саморазряда. Если от даты выпуска до установки на машину прошло полгода и больше, необходимо зарядить аккумулятор автомобиля. Точный ответ даст проверка состояния батареи.

Если знать все нюансы, как правильно заряжать аккумулятор автомобиля, которые заключаются в регулярной проверке плотности электролита, очистке клемм, своевременном исполнении процедуры — батарея долго будет долго и безотказно служить на радость владельцу.

Официальный интернет-портал Администрации Томской области — Ошибка

array
(
    'code' => 404
    'type' => 'CHttpException'
    'errorCode' => 0
    'message' => 'Невозможно обработать запрос \"uploads/ckfinder/298/userfiles/files/%d0%9f%d0%9e%d0%a2%20%d0%a0%d0%9e-14000-005-98%20%d0%9f%d0%be%d0%bb%d0%be%d0%b6%d0%b5%d0%bd%d0%b8%d0%b5%20%d1%80%d0%b0%d0%b1%d0%be%d1%82%d1%8b%20%d1%81%20%d0%bf%d0%be%d0%b2%d1%8b%d1%88%d0%b5%d0%bd%d0%bd%d0%be%d0%b9%20%d0%be%d0%bf%d0%b0%d1%81%d0%bd%d0%be%d1%81%d1%82%d1%8c%d1%8e_%20%d0%9e%d1%80%d0%b3%d0%b0%d0%bd%d0%b8%d0%b7%d0%b0%d1%86%d0%b8%d1%8f%20%d0%bf%d1%80%d0%be%d0%b2%d0%b5%d0%b4%d0%b5%d0%bd%d0%b8%d1%8f.docx\".'
    'file' => '/var/www/production/yii/framework/yiilite. php'
    'line' => 1803
    'trace' => '#0 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1719): CWebApplication->runController(\'uploads/ckfinde...\')
#1 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1236): CWebApplication->processRequest()
#2 /var/www/production/public/index.php(72): CApplication->run()
#3 {main}'
    'traces' => array
    (
        0 => array
        (
            'file' => '/var/www/production/yii/framework/yiilite.php'
            'line' => 1719
            'function' => 'runController'
            'class' => 'CWebApplication'
            'type' => '->'
            'args' => array
            (
                0 => 'uploads/ckfinder/298/userfiles/files/%d0%9f%d0%9e%d0%a2%20%d0%a0%d0%9e-14000-005-98%20%d0%9f%d0%be%d0%bb%d0%be%d0%b6%d0%b5%d0%bd%d0%b8%d0%b5%20%d1%80%d0%b0%d0%b1%d0%be%d1%82%d1%8b%20%d1%81%20%d0%bf%d0%be%d0%b2%d1%8b%d1%88%d0%b5%d0%bd%d0%bd%d0%be%d0%b9%20%d0%be%d0%bf%d0%b0%d1%81%d0%bd%d0%be%d1%81%d1%82%d1%8c%d1%8e_%20%d0%9e%d1%80%d0%b3%d0%b0%d0%bd%d0%b8%d0%b7%d0%b0%d1%86%d0%b8%d1%8f%20%d0%bf%d1%80%d0%be%d0%b2%d0%b5%d0%b4%d0%b5%d0%bd%d0%b8%d1%8f. docx'
            )
        )
        1 => array
        (
            'file' => '/var/www/production/yii/framework/yiilite.php'
            'line' => 1236
            'function' => 'processRequest'
            'class' => 'CWebApplication'
            'type' => '->'
            'args' => array()
        )
        2 => array
        (
            'file' => '/var/www/production/public/index.php'
            'line' => 72
            'function' => 'run'
            'class' => 'CApplication'
            'type' => '->'
            'args' => array()
        )
    )
)
Официальный интернет-портал Администрации Томской области — Ошибка | Департамент по социально-экономическому развитию села Томской области

404

Просим прощения, ведутся технические работы

/var/www/production/yii/framework/yiilite. php at line 1803

#0 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1719): CWebApplication->runController('uploads/ckfinde...')
#1 /var/www/production/yii/framework/yiilite.php(1236): CWebApplication->processRequest()
#2 /var/www/production/public/index.php(72): CApplication->run()
#3 {main}

ТЕРАФЛЮ ЭКСТРАТАБ N10 ТАБЛЕТКИ ПОКРЫТЫЕ ПЛЕНОЧНОЙ ОБОЛОЧКОЙ

Парацетамол

Антикоагулянтный эффект варфарина и других кумаринов может быть усилен при длительном регулярном применении парацетамола, при этом увеличивается риск кровотечения. Периодическое применение парацетамола не имеет существенного влияния.

Гепатотоксические вещества могут привести к накоплению парацетамола и передозировке. Риск гепатотоксичности парацетамола усиливается при применении препаратов, индуцирующих микросомальные ферменты печени, такие как барбитураты, противоэпилептические препараты (например, фенитоин, фенобарбитал, карбамазепин) и лекарственные средства для лечения туберкулеза, такие как рифампицин и изониазид.

Метоклопрамид повышает скорость всасывания парацетамола и увеличивает его максимальную концентрацию в плазме крови. Аналогичным образом, домперидон может привести к увеличению скорости абсорбции парацетамола.

Парацетамол может приводить к увеличению периода полувыведения хлорамфеникола.

Парацетамол может привести к снижению биодоступности ламотриджина, при возможном снижении эффекта последнего, что может привести к возможному индуцированию метаболизма в печени.

Абсорбция парацетамола может быть снижена при одновременном применении с холестирамином, но снижение всасывания незначительно, если холестирамин применяют на час позже. Регулярное применение парацетамола одновременно с зидовудином может вызвать нейтропению и повысить риск повреждения печени.

Пробенецид влияет на метаболизм парацетамола. У пациентов, одновременно применяющих пробенецид, доза парацетамола должна быть снижена.

Гепатотоксичность парацетамола усиливается при длительном чрезмерном употреблении этанола (алкоголя). Парацетамол может повлиять на результаты тестов фосфорновольфрамовой мочевой кислоты.

Фенилэфрина гидрохлорид

Данный препарат противопоказан у пациентов, принимающих или принявших ингибиторы моноаминоксидазы в течение последних двух недель. Фенилэфрин может потенцировать действие ингибиторов моноаминоксидазы и индуцировать гипертонический криз. Сопутствующее применение фенилэфрина с другими симпатометическими препаратами либо трициклическими антидепрессантами (например, амитриптилином) может привести к увеличению риска нежелательных реакций со стороны сердечно-сосудистой системы.

Применение фенилэфрина может привести к снижению эффективности бета-адреноблокаторов и других гипотензивных средств(например, дебризохина, гуанетидина, резерпина, метилдопы). Может повышаться риск артериальной гипертензии и других сердечнососудистых нежелательных реакций.

Сопутствующее применение фенилэфрина с дигоксином и сердечными гликозидами может привести к повышению риска нарушения ритма сердца или сердечного приступа.

Сопутствующее применение алкалоидов спорыньи (эрготамина) может повысить риск эрготизма.

Хлорфенамина малеат

Антигистаминные препараты, такие как хлорфенамин, могут усилить эффект опиоидных анальгетиков, антиконвульсантов, антидепрессантов (трициклических и ингибиторов моноаминоксидазы), других антигистаминных, противорвотных и антипсихотических препаратов, анксиолитиков, снотворных средств, этанола (алкоголя) и других депрессантов центральной нервной системы.

Поскольку хлорфенамин в некоторой степени обладает антихолинергической активностью, эффекты антихолинергетических препаратов (например, некоторых психотропных средств, атропина и препаратов для лечения недержания мочи) могут быть усилены при применении данного препарата. Это может привести к появлению тахикардии, сухости слизистой оболочки полости рта, нарушений со стороны желудочно-кишечного тракта (например, коликам), задержки мочи и головной боли.

Метаболизм фенитоина может подавляться хлорфенамином при этом возможно развитие токсичности фенитоина.

Печень & Желчный | Елена Корнилова

«Ты водишь ее в дорогие бары, угощаешь дорогими коктейлями, тратишь на нее всю свою зарплату, а в итоге она тебе отказывает», «Только вылечишь душу, сразу начинает болеть печень» — пожалуй, ни один орган человеческого тела не удостоился такого количества шуток и демотиваторов, как печень. На самом деле, смешного, конечно, мало. Заботиться о печени нужно постоянно, чтобы никогда не узнать, что такое жировой гепатоз, цирроз или печеночная недостаточность.

Печень расположена под диафрагмой в правой верхней части брюшной полости и является самым большим органом человека: ее вес достигает примерно 1,4 кг. Объем печени настолько велик, что, вероятно, никогда не будет полностью востребован организмом. Но иногда этот лишний объем может быть жизненно важен.

Печень больше любого другого органа подвержена воздействию токсинов. К счастью, лишь после разрушения до 70% печени возникает серьезная угроза здоровью.

Печень — это своего рода химический завод, чьи функции далеко не исчерпываются секрецией желчи.

Функции печени

Пищеварительная функция
Печень является крупнейшей пищеварительной железой. Она образует желчь, включающую воду (82%), желчные кислоты (12%), фосфатидилхолин (4%), и удаляемые из организма вещества — холестерол (0,7%), прямой билирубин и др.

Желчь обеспечивает эмульгирование и переваривание жиров пищи, стимулирует перистальтику кишечника. Без желчи не усваиваются жирорастворимые витамины — ни самая дорогая Омега, ни витамин Д, ни какие-либо другие.

Экскреторная функция
Экскреторная функция близка к пищеварительной: с помощью желчи выводятся прямой билирубин, немного креатинина и мочевины, продукты распада стероидных гормонов, ксенобиотики и продукты их обезвреживания, холестерол. Последний выводится из организма только в составе желчи.

Секреторная функция​
Печень осуществляет биосинтез и секрецию в кровь альбумина и некоторых белков других фракций, белков свертывающей системы, липопротеидов, глюкозы, кетоновых тел, 25-оксикальциферола, креатина, гепсидина. Также в печени производятся многие гормоны, ферменты и т. д.

Депонирующая функция
В печени находятся резервы гликогена, накапливаются минеральные вещества, особенно железо, витамины A, D, K, B12 и фолиевая кислота.

Главный фильтр человеческого организма

Детоксикация — еще одна из основных функций печени. Именно печень нейтрализует последствия неправильного образа жизни и неблагоприятной экологии. Сегодня токсическое воздействие происходит не только со стороны вдыхаемого воздуха и водопроводной воды.

Зубные пломбы, косметика, пластиковые окна и батарейки, морские и мясные продукты, фрукты и овощи также содержат токсические вещества.

Общее токсическое воздействие складывается из четырех моментов:

  • физическое воздействие
  • травмы, воспаление, чрезмерные физические нагрузки
  • токсины питательных веществ
  • консерванты, пестициды, гормоны, алкоголь, трансжирные кислоты
  • инфекционное воздействие
  • бактерии, грибы, паразиты
  • химическое воздействие (ксенобиотики, органические соединения)

Очень опасными продуктами с токсическими свойствами являются летучие органические вещества (ЛОВ). В городском воздухе постоянно присутствуют ксилол, бензол, этилбензол, трихлорэтан и др. Но источником наибольшего воздействия летучих органических веществ (растворителей) является домашний воздух. Концентрация ЛОВ в воздухе в помещении в 10 раз выше, чем на улице! Те же ковры содержат десятки видов ЛОВ и около 12 компонентов пестицидов.

Ксенобиотики (чужеродные для организма химические соединения) поступают в организм через кожу, дыхательные пути и кишечник. Слизистая оболочка кишечника является первичным барьером для проникновения токсических компонентов и макромолекул из принятой пищи. Нарушения кишечной иммунной системы или механических барьеров (повышение проницаемости стенки кишечника) могут привести к усиленному поступлению токсических компонентов, которые затем попадают в печеночную систему детоксикации для переработки и выведения, перегружая ее.

Печень не просто отфильтровывает токсины из крови — она преобразует их в безопасные для здоровья соединения, которые выводятся естественным путем. Но при большой нагрузке печень не успевает справляться с работой, и токсины начинают накапливаться, что неизбежно сказывается на самочувствии.

Токсины возвращаются в кровоток и вызывают множество недомоганий — обостряются аллергии, у людей со слабыми венами усиливаются проявления варикоза и т. д. Даже у здоровых в целом людей самочувствие становится заметно хуже.

Первым признаком интоксикации и неправильной работы печени является повышение утомляемости или небольшое усиление хронической усталости, однако в конечном итоге интоксикация нарушает функцию нервной системы, функцию иммунной системы и функцию эндокринной системы.

Классические признаки плохой работы печени и желчного пузыря

На интоксикацию организма указывают следующие симптомы:

  • хроническая усталость и постоянный недостаток энергии;
  • тревога и депрессия
  • ухудшение умственных способностей;
  • усугубление различных симптомов при воздействии химикатов;
  • непереносимость алкоголя и запахов химических веществ;
  • тупые головные боли, которые снимаются после отдыха или головные боли в районе за глазами;
  • отеки и темные круги под глазами;
  • выпадение волос;
  • угревые высыпания на лице и теле,
  • землистый цвет лица
  • плохая переносимость физических нагрузок;
  • хронические боли в суставах или мышцах;
  • варикоз;
  • чрезмерное потоотделение с неприятным запахом
  • постоянный неприятный запах изо рта, обложенный язык;
  • газы, вздутие живота, боли в животе, запор, диарея;
  • гормональный дисбаланс (фибромы, миомы, мастопатия)

Печеночно-клеточная недостаточность также проявляется в возникновении на коже сосудистых звездочек, гиперемии ладоней и ступней, покраснении кожи лица, увеличении слюнных желез, феминизации у мужчин, спонтанных гематомах, искривлении пальцев рук, появлении «барабанных пальцев», возникновении на ногтях светлых пятен, пожелтении цвета кожи.

Фазы детоксикации печени

Печень обладает двумя механизмами для удаления нежелательных химикатов из организма. Эти нежелательные вещества по природе жирорастворимые и поэтому сложны для транспортировки через клеточные мембраны для выведения. Печень может химически разрушить вещество через реакции окисления (Фаза 1) и конъюгации (Фаза 2). Эти реакции делают вещество более полярным или водорастворимым, тем самым способствуя более легкому его выведению из организма с мочой или желчью.

Процесс биотрансформации проходит большое количество ксенобиотиков типа энтеротоксинов (токсинов, эндогенно образуемых кишечными бактериями), эндобиотиков (промежуточных и конечных продукты нормального метаболизма и превращения энзимов) и экзотоксинов (токсические химикаты, которые попадают в организм с пищей и воздухом и абсорбируются).

Обе фазы имеют свои достоинства и недостатки, их совместное функционирование особенно эффективно и в большинстве случаев приводит к превращению многих тысяч ксенобиотиков в более гидрофильные и менее токсичные метаболиты. Процессы связывания и выведения также защищают от ксенобиотиков.

Не забывайте, что время максимальной активности печени приходится на период с 23 до 3−4 часов ночи. В этот период почти все другие органы отдыхают, но печень и желчный пузырь работают с полной нагрузкой, проводя работу по обезвреживанию токсинов и очищению крови. Именно поэтому не стоит есть на ночь: печень должна тянуть токсины из глубоких тканей, а не круглосуточно включаться в работу по перевариванию пищи.

Фаза детоксикации I — трансформация

Ферменты Фазы I непосредственно нейтрализуют некоторые химические вещества, но многие из них преобразуются в промежуточные соединения, которые обрабатываются ферментами Фазы II. Промежуточные продукты Фазы I в основном более активны химически и поэтому более токсичны.

Фаза детоксикации I включает группу из 50−100 ферментов, которая называется цитохром Р450 (CYPs). Каждый из этих ферментов взаимодействует с определенным типом химических веществ с небольшим пересечением полей действия. Активность различных ферментов цитохрома Р-450 генетически детерминирована и значительно варьируется у разных людей.

Вещества, повышающие уровень и избыточную активность Р450 называются индукторами, а снижающие — ингибиторами. Свойствами индукторов обладают барбитураты, алкоголь, кофеин, никотин, стероиды, насыщенные жиры, пестициды и др. В качестве ингибиторов известны левомицетин, циметидин, тетурам, силибор и др.

Естественные пищевые субстанции, которые могут активировать Фазу детоксикации I: кочанная капуста, брокколи, брюссельская капуста, высокопротеиновая диета, апельсины и мандарины, тмин и семена укропа. Нутриенты, активирующие Фазу I: ниацин, витамин В1 (тиамин) и витамин С.

В большинстве случаев ферменты начинают процесс по химическому превращению жирорастворимых соединений в водорастворимые соединения. CYPs ферменты относительно неспецифичны, каждый из них имеет потенциал, чтобы распознавать и изменять множество токсинов. Некоторые способны нейтрализовать любые токсины, которые попадут в организм. Такая универсальность сказывается на скорости.

CYPs метаболизируют токсины очень медленно, в отличие от других ферментов. Для сравнения: преобладающий цитохром P450 3A4 (сокращённо CYP3A4) способен усвоить 1−20 молекул в секунду, в то время как супероксиддисмутаза разлагает более миллиона молекул в секунду.

Основным способом преодоления медленной скорости является производство CYPs в больших объемах. Они могут составлять до 5% от общего белка печени, большие концентрации могут быть найдены и в кишечнике.

Несколько ферментов, участвующих в фазе I, отвечают за детоксикацию никотина из сигаретного дыма, алкоголя, разрушают серотонин, дофамин и адреналин в нейронах, являются объектами некоторых антидепрессантов.

Фаза I может замедлить работу из-за отсутствия притока крови, который может быть обусловлен старением или отсутствием физической активности. Также процесс может замедлиться из-за дефицита витаминов и минералов, кофакторов, необходимых для фазы I, включая витамины В2 и В3, магний и железо. Тяжелые металлы в крови также пагубно влияют на этом этапе.

Ухудшение самочувствия при воздействии химических веществ — замедленная фаза детоксикации I. Некоторые люди имеют слабо функционирующую первую фазу детоксикации, их можно назвать «‎замедленными, слабыми детоксикаторами».

Люди, употребляющие некоторые медикаменты, находящиеся на гормонозаместительной терапии эстрогенами, принимающие кок, употребляющие много алкоголя, имеющие заболевания печени, дефицит кофакторов (витаминов, минералов, аминокислот) замедляют эту фазу.

Самый важный антиоксидант, нейтрализующий свободные радикалы, который производится в Фазе детоксикации I — глутатион. В процессе нейтрализации свободных радикалов глутатион окисляется в дисульфид глутатиона. Когда, благодаря высокой степени токсиноустойчивости, в Фазе детоксикации I производится слишком много свободных радикалов, запасы глутатиона истощаются. В свою очередь, процессы Фазы детоксикации II, которые также зависят от наличия глутатиона, замедляются или останавливаются. Поэтому очень важно обеспечить доступный запас глутатиона, чтобы уровень производства ферментами Фазы I активных промежуточных соединений соответствовал уровню завершения своих процессов ферментами Фазы II.

Первую фазу детоксикации поддерживают: витамины А, Е, Д; витамин С и флавоноиды; медь; фосфатидилхолин; магний; цинк, железо; глутатион (аминокислоты глицин, метионин, цистеин, таурин) и витамины В2, В3, В6, В9, В12.

Фаза детоксикации II — ферментативное расщепление

После первой фазы трансформации исходный жирорастворимый токсин был преобразован в более водорастворимую форму, однако эта промежуточная форма по-прежнему не подходит для немедленной его ликвидации из клетки по нескольким причинам:

  • первого этапа реакции в большинстве случаев недостаточно, чтобы сделать токсин достаточно водорастворимым, дабы завершить весь путь экскреции;
  • во многих случаях продукты реакции после фазы детоксикации I предоставлены более реактивной формой, чем оригинальные токсины, что делает их потенциально еще более разрушительными, чем это было раньше.

Оба этих недостатка учитываются в деятельности ферментов фазы II, которые изменяют продукты фазы I, не только увеличивая их растворимость, но и снижая их токсичность. Активация ферментов II фазы отвечает за антимутагенные и антиканцерогенные свойства метаболических систем детоксикации. Признано, что ферменты II фазы защищают от химического канцерогенеза, особенно на этапе инициации рака.

Некоторые пищевые компоненты, например, сульфорафан из брокколи, ксантогумол из хмеля оказывают стимулирующее действие на антиоксидантную активность фермента, тем самым оказывая благотворное влияние на детоксикацию.

Добавки из брокколи можно принимать как курсами, так и на постоянной основе. Исследований очень много. Например, британские ученые доказали способность сульфорафана повышать уровни внутриклеточного глутатиона, а японские оценили влияние экстракта брокколи на патологию печени у мужчин.

Фазу II часто называют реакциями конъюгации (присоединения), они протекают с участием различных ферментов, в процессе которых образуются соединения нетоксичные, водорастворимые, легко выводимые из организма.

Фаза детоксикации II включает 6 цепочек реакций: конъюгация глутатиона; конъюгация аминокислот; метилирование; сульфатирование; ацетилирование; глюкуронидация. Некоторые химические вещества могут пройти через несколько реакций.

Активность ферментов Фазы детоксикации II также снижается с возрастом. Если печень не получает питательные вещества, в которых она так нуждается, то она «перезагружается» работой и отсылает токсины в глубокие органы и ткани, вызывая их дисфункцию.

Для эффективности Фазы детоксикации II клеткам печени необходима сера, содержащая такие аминокислоты как таурин и цистеин. Источниками природных соединений серы являются яйца, овощи семейства крестоцветных (например, брокколи, кочанная капуста, брюссельская капуста, цветная капуста), чеснок, репчатый лук, лук-порей.

Замедляют фазу нестероидные противовоспалительные (ибупрофен, аспирин и др.), низкопротеиновые диеты. Зачастую фаза II страдает у вегетарианцев.

Кофакторы для фазы детоксикации II: глицин, глютамин, инозитол, марганец, цистеин, метионин, селен, таурин, В 12, витамин С, цинк, фолат, липоевая кислота.

Еще немного о реакциях фазы II

Сульфатация
Этот путь добавляет группу сульфат для ряда химических веществ, включая эндотоксины от бактерий и целый ряд экологических токсинов, включая Bisphenol, А и Xenoestrogens. Это также основной путь для ликвидации отработавших стероидных гормонов щитовидной железы и нейромедиаторов.

Сера в группе сульфата получается из аминокислот, которые содержат серу (метионина и цистеина), для этой фазы необходимы кофакторы: молибден, В12, фолиевая кислота, магний, В6, таурин.

Глюкуронизация
Глюкуроновая кислота является производным от глюкозы. Печень добавляет группы при детоксикации таких веществ, как аспирин, фенолы, стероиды, морфин, левомицетин, консерванты, стероидные гормоны, билирубин, карбонаты, нафталин, пестициды, некоторые метаболиты табака.

Конъюгация с глутатионом
Глутатион является не только основным антиоксидантом для печени, ликвидирующим свободные радикалы, как следствие фазы I: через данный путь выводятся химические вещества, тяжелые металлы, растворители, пестициды. Наиболее опасные канцерогены — ПАУ, полициклические ароматические углеводороды (простейший из них — бензол).

Этот процесс требует глутатиона и строительных аминокислот для него: цистеина, глутаминовой кислоты и глицина. Также можно поддержать уровень глутатиона другими антиоксидантами, например, альфа-липоевой кислотой, витамином С, NAC и SAMe.

Ацетилирование
Один из наиболее распространенных биохимических процессов в организме (гликолиз) производит конечный продукт под названием пируват, который затем становится ацетилкоферментом, А (через окисление пирувата в митохондриальной мембране). В этой фазе выводится гистамин, серотонин, салициловая кислота, табак, выхлопные газы. Для реакции необходимы молибден, железо, витамины В1, В2, В3, В5 и витамин С.

Метилирование
Самый известный путь получил наибольшее внимание в последнее время в связи с частыми разговорами о MTHFR мутациях. Метилирование предполагает добавление метильной группы (-СН3) для различных видов гормонов, нейротрансмиттеров или токсинов, делая их водорастворимыми. Амины (серотонин и мелатонин, гистамин, дофамин, норадреналин, адреналин) выводятся через этот путь, а также салициловая кислота, аспирин, каннабиноиды, эстрадиол и BPA.

Метилирование обеспечивает более 40 000 реакций в организме. Поэтому наличие мутаций фолатного цикла может давать психический/эмоциональный дисбаланс, мигрени, гормональный дисбаланс (особенно эстрогендоминирование).

Гиперметилирование или гипометилирование как бы «включают» и «выключают» активность определенных генов (при гиперметилирование слишком много всего выводится, при гипо — слишком мало).

Основной метил группы доноров поступает из аминокислоты метионина, который преобразуется в SAMe, являющимся метильным донором. Он может быть разбит на цистеин и дальше либо превратиться в сульфат, либо в глутатион (для глутатионтрансферазы, или как антиоксидант для фазы I), здесь нет отходов.

Кофакторы для реакции: витамин В12, фолиевая кислота, магний, холин, метионин, бетаин и молибден

Лабораторные исследования

Оценить статус кофакторов для фаз детоксикации помогут:

Анализ мочи на органические кислоты
На исследование сдается утренняя моча, за 8−10 часов до сдачи анализа не есть, не употреблять алкоголь, на два дня исключить витамины, не нервничать, не заниматься сексом, исключить сладкое и жирное. Рацион должен быть легким.

  • Кинурениновая кислота (метаболит витамина В6) — показатели выше нормы свидетельствуют о дефиците витамина В6. В этом случае необходим прием витамина В6 в коэнзимной форме P-5-P (пиридоксальфосфат).
  • Формимино-глютаминовая кислота — дефицит витамина В9.
  • Метилмалоновая кислота — дефицит В12.
  • Высокий/низкий уровень пироглутаминовой кислоты — дефицит глутатиона.
  • Альфа-кетоглутаровая кислота — дефицит ниацина, коэнзима, А (либо его прекурсоров — В5, магния, цистеина).
  • Пара-гидроксифенилмолочная кислота — дефицит витаминов Е, С.
  • Бета-гидрокси-изовалериановая кислота, субериновая кислота — дефицит B2.
  • Глюкаровая кислота — дефицит NAC.
  • Оротовая кислота — возможная необходимость в магнии.

Анализ крови
В плазме крови (сдавать натощак, не есть 10−12 часов) можно посмотреть таурин, метионин, глицин, цистеин — они не должны быть низкими. В противном случае — это показатель нарушения метаболизма серы, необходимой для фазы детоксикации II.

Также можно сдать анализ крови на микроэлементы (железо, цинк, медь, марганец), ферритин (высокий уровень железа снижает активность фазы I), посмотреть уровень витамина Д и гомоцистеина.

Что необходимо сделать до начала проведения детоксикации

Наладить выработку и отток желчи

Поработать с кишечной флорой, почками (кишечник и почки выводят водорастворимые токсины, очень плохо, если они не работают как надо).

Обеспечить антиоксидантную поддержку, чтобы фаза I не привела к серьезной нагрузке.

Уменьшить объем жировой ткани и мобилизовать жирорастворимые токсины. Для этого желательно посещать (в том числе и во время детоксикации) инфракрасную сауну, принимать ванну с epsom salt — полезно всё, что помогает потеть. Обязателен спорт, но, конечно, не изнуряющий, выбирать нагрузку нужно по силам.

Способствовать выведению тяжелых металлов из тканей (опять же, потеть, снизить лишний вес).

Восполнить необходимые нутриенты для обеих фаз.

Не следует забывать, что все витамины и минеральные вещества из еды мы получаем только в том случае, если нет проблем с их усвоением, нет гастритов, пернициозной анемии, ахлоргидрии, ферментативной недостаточности! В противном случае необходимы активные коэнзимные формы витаминов и хелатные формы минералов.

Все пожилые люди имеют проблемы скрытого дефицита витаминов В9, В12, и так как есть проблемы с образованием желудочной кислоты, из еды они их получить не могут.

До 2-х месячного возраста метаболизм ксенобиотиков практически не происходит. В старческом возрасте обменные процессы замедляются. Поэтому у детей чаще проявляются побочные токсические эффекты лекарств, а у пожилых к ряду лекарств повышена чувствительность. Кстати, пол тоже имеет значение: у мужчин лекарства «обезвреживаются» быстрее.

Стресс посредством глюкокортикоидов способен увеличивать активность ферментов метаболизма ксенобиотиков.

Симптомы проблем с желчным

Желчный пузырь — является резервуаром для накопления желчи, расположен на нижней поверхности печени, имеет форму овального мешка, величиной с небольшое куриное яйцо.

О проблемах с желчным свидетельствует:

  • Нарушение функции кишечника (желчь — натуральное слабительное, избыток желчи приводит к диарее, недостаточность — к запорам)
  • Метеоризм
  • Снижение аппетита
  • Рвота
  • Отвращение к жирной пище
  • Боли в правом подреберье
  • Горечь во рту
  • Боли в височной области
  • Боли в суставах

В анализах на неадекватную работу желчного указывает повышение прямого билирубина, щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтранспептидазы, гамма-глобулиновых фракций; снижение альбумина, повышение аст и алт. В общем анализе крови повышаются лейкоциты, СОЭ, эозинофилы.

Функции желчи

Желчь относится к пищеварительным сокам, однако она выполняет и выделительную функцию, так как с нею выводятся из крови разные экзогенные и эндогенные вещества. Желчь повышает активность ферментов панкреатического сока поджелудочной железы, и прежде всего, липазы.

Желчные кислоты играют огромную роль в усвоении жиров. Они эмульгируют нейтральные жиры, разбивая их на мельчайшие капельки, в результате чего увеличивается поверхность их соприкосновения с ферментами, облегчается расщепление жиров, повышается активность поджелудочной и кишечной липазы. Желчь необходима для всасывания жирных кислот и, следовательно, жирорастворимых витаминов.

Желчь, образующаяся в печени, недостаточно концентрирована, в малом количестве. То есть желчный нам дан неслучайно: необходимо достаточное количество желчи для обработки жирных кислот и витаминов. Если желчи нет или она недостаточно концентрирована, жиры не растворяются, а проходят лишь первичные стадии эмульгирования. Организм начинает испытывать недостаток питательных веществ — эссенциальных жирных кислот (например, Омега 3−6-9). К этому присоединяются симптомы дефицита витамина, А (страдает иммунитет, зрение), витамина Е (отвечает за иммунитет, красивую кожу, состояние клеточных мембран), витамин Д (если не усваивается витамин Д — остеопороз обеспечен), витамина К (дефицит приводит к кальцификации сосудов и т. д.).

Признаки дисбаланса жирных кислот и жирорастворимых витаминов

Вот список самых распространенных симптомов:

  • сухая кожа;
  • раздражительность;
  • нарушение внимания;
  • мягкие ногти;
  • аллергии «крокодилья кожа»;
  • снижение активности иммунной системы;
  • слабость и утомляемость;
  • сухие «неуправляемые» волосы;
  • ломкие ногти;
  • «куриная» кожа на боковой поверхности рук;
  • плохое заживление ран;
  • экзема.

Также желчь стимулирует секрецию и перистальтику кишечника; инактивирует пепсин в двенадцатиперстной кишке, оказывает бактерицидное и бактериостатическое действие на кишечную флору, улучшает процесс обновления эпителиоцитов тонкой кишки, усиливает гидролиз и всасывание белков и углеводов.

Что приводит к дисфункции желчного пузыря

Для эффективной работы желчного пузыря и оттока желчи необходима достаточная продукция желудочной кислоты (HCl). Ее образование резко падает после 40 лет, в результате дефицитов, приема комбинированных оральных контрацептивов. .

Также к дисфункции желчного пузыря приводит:

  • ​недостаток клетчатки в рационе
  • пищевые непереносимости, аллергии
  • хроническое воспаление в организме
  • прием статинов
  • недостаточная двигательная активность
  • обезвоженность
  • частые негативные эмоции

Сама желчь относится к гуморальным желчегонным факторам. Поэтому в состав таких хорошо всем известных препаратов как аллохол, холензим входит желчь. Усиливают секрецию желчи гастрин, ХЦК-П3 (холецистокинин панкреозимин), секретин, простагландины. Некоторые пищевые продукты (яичные желтки, молоко, жирная пища, хлеб, мясо) стимулируют желчеобразование и желчевыведение.

Повышают выработку желчи липотропные факторы (таурин, холин, инозитол, метионин, лецитин) и желчегонные средства (травы, стимулирующие выработку желчи в печени — свекла, испанская черная редька, алоэ вера)

Помогают увеличить выделение желчи желчегонные средства — горькие плоды: Taraxacum (корень одуванчика), Chelidonium (чистотел большой), Cynara (листья артишок), Rosmarinus (розмарин), Mentha (перечная мята), Humulus (хмель).

Камни и полипы в желчном

Причины появления полипов: дефицит йода, дефицит витаминов группы В, вирусные инфекции, паразитарные инвазии (в полипах любят «прятаться» круглые черви). Полипы и камни в желчном пузыре — всегда следствие загущения желчи и смещения фракции в сторону билирубина и холестерина.

При полипах хорошо работают высокие дозы серрапептазы (рассасывают полипы), йод, и, конечно, полная поддержка печени и желчного.

В желчи также содержатся: вода, фосфолипиды и желчные соли — в норме, большей частью фосфатидилхолин. Когда процент холестерина (из него образуется желчь) превышает фосфатидилхолин (делает желчь более текучей), желчь становится густой, образуется застой. Уровень холестерина в крови может расти, и циркуляция крови нарушается.

В связи с застоем желчи повышается ее концентрация и усиливается рост камней. Воспалительный процесс, возникнув первично или вторично, является мощным регулятором дальнейшего развития нарушения стабильности липидного комплекса желчи и является пусковым механизмом в образовании камней в желчном пузыре.

Самые опасные камни — камни в желчном протоке, размерами от 0,8 см до 1,3 см — они могут забить проток. С такими камнями следует быть очень осторожными в плане приема желчегонных средств. И никаких резких движений! Камни можно «раздробить» приемом БАДов, различной терапией, например, ультразвуковой. А вот урсофальк, который многие врачи прописывают для дробления камней, увы, не всегда работает.

Камни в желчном пузыре — это результат перегруженной печени, густой застойной желчи. Изначально камни образуются в печени, поэтому удаление желчного пузыря не решает проблему.

Желчь копится в желчном пузыре до поступления жирной или белковой пищи (нам необходимо достаточное количество желчи для каждой еды, содержащей жиры и белки). Сама по себе желчь едкая, разъедающая. После удаления желчного она не скапливается ни в каком «резервуаре», а сразу подтекает в кишечник и раздражает стенки толстой кишки. Многие после удаления желчного страдают синдромом раздраженного кишечника, хронической диареей, дисбактериозом.

Общие рекомендации при удаленном желчном
  • Употреблять лецитин и фосфатидилхолин 2−3 грамма при каждом приеме пищи, таурин за 40 минут до 500 мг.
  • Подключить препараты, содержащие желчь.
  • Ежедневно принимать клетчатку (подтекающая желчь раздражает стенки кишечника и имеет канцерогенный эффект).
  • Принимать пробиотики.
  • Принимать бетаин/пепсин при ахлоргидрии.
  • Принимать ферменты с липазой (особенной с пищей, где есть жиры или при приеме жирорастворимых витаминов и жирных кислот).
  • Добавки: лецитин, фосфатидилхолин, холин, таурин, куркумин, артишок, силимарин.
  • Сок свеклы, редьки натощак, гринсы Amazing Grass.
Синдром Жильбера

При синдроме Жильбера повышен именно непрямой билирубин. Непрямой билирубин — продукт распада гемоглобина, детоксицируется, как и многие гормоны, с помощью глюкуронизации. Повышение уровня непрямого билирубина — это всегда проблемы с реакцией глюкуронизации.

Присоединение глюкуроновой кислоты с помощью глюкуронилтрансферазы к билирубину превращают его из непрямого в прямой, образуя нетоксичный прямой билирубин с последующим выведением его с желчью. То есть у людей с синдромом Жильбера в печени мало активен фермент, ответственный за перевод непрямого билирубина в прямой и за счет этого непрямой билирубин накапливается. И все равно организм в состоянии справиться, но триггерами обострения могут стать минеральные дефициты, дефициты таурина, глицина, витаминов группы В, проблемы метиляции. Частые стрессы, повышенные физические нагрузки, голодания, недосыпы, избыток углеводов в питании также могут давать обострения.

Симптомы обострения — усталость, раздражительность, затуманенность сознания, тревожные состояния, частые головокружения, иногда депрессии, чувство горечи во рту, желтизна кожи/склер, сухость, зуд и крапивницы.

Глюкуронилтрансфераза в печени участвует в детоксикации многих токсинов: эстрогенов, андрогенов, наркотических веществ, порфиринов. Такие медикаменты, как рифампицин, левомицетин, парацетамол, оральные контрацептивы будут усугублять ситуацию. То есть при синдроме Жильбера происходит снижение функций детоксикации печени, и в долгосрочной перспективе это может привести к накоплению большого количества токсических веществ.

Усиливают активность глюкуронилтрансферазы при синдроме Жильбера:

  • кофе
  • розмарин (особенно UGT1A6)
  • эллаговая кислота (найдена в грецких орехах, пекан, гранат, виноград, ягоды)
  • гидроксилимонная кислота (в целых зернах кофе)
  • кверцетин (есть во многих фруктах и овощах)
  • дубильные кислоты
  • кумарин (во многих растениях, бобы тонка, кассия, корице)
  • фумаровая кислота
  • куркумин (куркума)
  • флавоны
  • астаксантин (каротиноиды)

Существует много продуктов питания и добавок, которые увеличивают активность неактивных ферментов печени или клеток кишечника, однако результаты исследований часто не являются окончательными, или прием добавок нехорошо переносится на животных и человеке.

Травы для лечения печени

Алоэ вера
Алоэ вера содержит антрахиноны, которые обладают противовоспалительными, очищающими, антиоксидантными и регенерирующими свойствами. Для того, чтобы получить максимальную выгоду от компонентов сока алоэ вера и очистить печень, рекомендуется принимать около двух недель 50 мл сока алоэ вера два раза в день (утром и вечером) и пить в течение дня напиток, состоящий из полулитра воды и полулитра алоэ вера.

Лимон
Лимон содержит активные компоненты, включая витамин C и лимонную кислоту, и часто используется в очищении печени. Рекомендуется пить в виде сока.

Одуванчик
И листья, и корни одуванчика содержат активные вещества, такие как тритерпены и активные горечи. Они оказывают мочегонное действие, повышает секрецию желчи, способствует выведению шлаков и токсинов и усиливают функции печени.

Расторопша
Известное гепатопротекторное растение, то есть способствует восстановлению функциональности клеток печени. Это возможно благодаря силимарину, который действует на паренхиму печени и способствует регенерации.

Артишок
Помогает секреции желчи, ее разжижению и увеличению объема, благодаря активному ингредиенту, содержащемуся в листьях, известному как цинарин. Он также оказывает мочегонное и очищающее действие на весь организма, защищает клетки печени от токсических веществ и стимулирует ее функции.

Все перечисленные выше лекарственные травы можно принимать в виде отвара, добавки или сиропа.

Немного психосоматики

К основным заболеваниям печени (абсцесс, камни, цирроз, печеночная недостаточность, вирусный гепатит, желтуха и опухоль) приводит эмоциональная блокировка. Выражение «исходить желчью» прекрасно объясняет общий метафизический смысл заболеваний печени.

Проблемы появляются, когда человек злится и беспокоится вместо того, чтобы проявить гибкость и приспособиться к ситуации. Он боится последствий, боится что-то потерять. Не сумев приспособиться к новой ситуации, он испытывает гнев и разочарование.

Болезни и расстройства печени говорят о том, что человек близок к депрессии, даже если он сам этого не осознает. В метафизике печень — это резервуар, в котором накапливается подавленный гнев.

Таким образом, проблемы с печенью обычно возникают у человека, который не выпускает свой гнев наружу, старается казаться спокойным, даже когда что-то или кто-то сильно его задевает. В душе человека накапливаются горечь и печаль. Если этот процесс длится долго, вместо приступа гнева, который принес бы этому человеку разрядку и вернул бы душевное спокойствие, происходит приступ какой-нибудь болезни печени.

Сульфатация — обзор | ScienceDirect Topics

1 Введение

Сульфатирование (также называемое сульфурированием) является важной посттрансляционной модификацией многих молекул, включая белки, углеводы и липиды. Реакция также является одним из основных конъюгирующих путей, ответственных за детоксикацию и последующую элиминацию ксенобиотиков и эндогенных малых молекул у эукариот. Модификация метаболитов путем добавления сульфогруппы может оказать сильное влияние на биологические свойства продуктов.В целом сульфатирование способствует растворимости акцепторных субстратов в воде, что приводит к инактивации и выведению биологически активных соединений из организма. Таким образом, сульфатирование играет важную роль в метаболизме и регуляции ключевых эндогенных соединений и детоксикации ксенобиотиков. Однако это не единственная биологическая функция данной реакции, и существует множество молекул, которые при сульфатировании либо сохраняют, либо приобретают другие биологические активности. В некоторых случаях наличие сульфатной группы на некоторых молекулах также может быть предпосылкой для их биологической функции.Например, прегненолон сульфат является одним из наиболее биологически важных нейростероидов у млекопитающих, и его снижение связано с некоторыми заболеваниями головного мозга (Korinek et al., 2011; Zheng, 2009). У человека сульфатирование обеспечивает отличный способ гомеостатического контроля гидрофобных сигнальных молекул, таких как оксистеролы и стероиды (Javitt, Lee, Shimizu, Fuda, & Strott, 2001; Ren et al., 2014; Strott & Higashi, 2003; Zheng, 2009), гормоны (Visser, van Buuren, Rutgers, Eelkman Rooda, & de Herder, 1990), пептиды (Farzan et al., 1999) и катехоламины (Coughtrie, Taskinen & Hood, 2002).

Роль сульфатированных соединений в организмах, кроме млекопитающих, менее ясна. У бактерий различные исследования показывают, что сульфатирование определенных субстратов играет важную роль в экологических и патологических взаимодействиях (Longo, Motta, Mauri, Landini, & Rossi, 2016). Историческим примером является установление специфического симбиоза между азотфиксирующей бактерией Sinorhizobium meliloti и растением Medicago sativa путем сульфатирования сигналов липоолигосахаридов, названных факторами Nod (Lerouge et al., 1990; Роше и др., 1991). Мутанты S. meliloti , лишенные пути сульфатирования, неспособны индуцировать образование клубеньков у люцерны, но приобретают способность колонизировать корни вики (Ehrhardt et al., 1995). У растений несколько сульфатированных брассиностероидов связаны с реакцией на патогены и синтезом связанных с патогенами сигналов метилжасмоната и салициловой кислоты (Jez, Ravilious, & Herrmann, 2016; Marsolais et al., 2007). Сообщалось также, что сульфатирование инактивирует биологическую активность 24-эпибрассинолида или флавоноидов, предполагая, что растения, как и животные, используют добавление сульфогруппы для регулирования запасов этих вторичных метаболитов (Hashiguchi et al., 2013, 2014; Руло и др., 1999).

После выделения сульфата холестерина из морской звезды Asterias rubens (Björkman, Karlsson, & Nilsson, 1972; Godfellow & Goad, 1973) было также описано несколько сульфатированных стеролов из широкого круга морских организмов, особенно из губок ( Aiello, Fattorusso, & Menna, 1999) и иглокожих (D’Auria, Fontana, Minale, & Riccio, 1990). Некоторые из этих молекул обладают широким спектром биологической активности и потенциального терапевтического применения.Особо следует отметить их активность против ВИЧ-1 (Tziveleka, Vagias, & Roussis, 2003) и патогенных грибков (Boonlarppradab & Faulkner, 2007; DiGirolamo, Li, Jacob, Clark, & Ferreira, 2009). Последние сообщения включают модуляцию рецепторов или регуляторных белков, таких как сиртуины (Nakamura et al., 2018), протеинкиназа Cζ (Whitson et al., 2009, 2008), прегнан-X-рецептор (Festa et al., 2011), и фарнезоид-Х-рецептор (Sepe et al., 2011).

Сульфатация — обзор | ScienceDirect Topics

1 Введение

Сульфатирование (также называемое сульфурированием) является важной посттрансляционной модификацией многих молекул, включая белки, углеводы и липиды.Реакция также является одним из основных конъюгирующих путей, ответственных за детоксикацию и последующую элиминацию ксенобиотиков и эндогенных малых молекул у эукариот. Модификация метаболитов путем добавления сульфогруппы может оказать сильное влияние на биологические свойства продуктов. В целом сульфатирование способствует растворимости акцепторных субстратов в воде, что приводит к инактивации и выведению биологически активных соединений из организма. Таким образом, сульфатирование играет важную роль в метаболизме и регуляции ключевых эндогенных соединений и детоксикации ксенобиотиков.Однако это не единственная биологическая функция данной реакции, и существует множество молекул, которые при сульфатировании либо сохраняют, либо приобретают другие биологические активности. В некоторых случаях наличие сульфатной группы на некоторых молекулах также может быть предпосылкой для их биологической функции. Например, прегненолон сульфат является одним из наиболее биологически важных нейростероидов у млекопитающих, и его снижение связано с некоторыми заболеваниями головного мозга (Korinek et al., 2011; Zheng, 2009). У людей сульфатирование обеспечивает отличный способ гомеостатического контроля гидрофобных сигнальных молекул, таких как оксистеролы и стероиды (Javitt, Lee, Shimizu, Fuda, & Strott, 2001; Ren et al., 2014; Стротт и Хигаси, 2003 г .; Zheng, 2009), гормоны (Visser, van Buuren, Rutgers, Eelkman Rooda, & de Herder, 1990), пептиды (Farzan et al., 1999) и катехоламины (Coughtrie, Taskinen, & Hood, 2002).

Роль сульфатированных соединений в организмах, кроме млекопитающих, менее ясна. У бактерий различные исследования показывают, что сульфатирование определенных субстратов играет важную роль в экологических и патологических взаимодействиях (Longo, Motta, Mauri, Landini, & Rossi, 2016). Историческим примером является установление специфического симбиоза между азотфиксирующей бактерией Sinorhizobium meliloti и растением Medicago sativa путем сульфатирования сигналов липоолигосахаридов, названных факторами Nod (Lerouge et al., 1990; Роше и др., 1991). Мутанты S. meliloti , лишенные пути сульфатирования, неспособны индуцировать образование клубеньков у люцерны, но приобретают способность колонизировать корни вики (Ehrhardt et al., 1995). У растений несколько сульфатированных брассиностероидов связаны с реакцией на патогены и синтезом связанных с патогенами сигналов метилжасмоната и салициловой кислоты (Jez, Ravilious, & Herrmann, 2016; Marsolais et al., 2007). Сообщалось также, что сульфатирование инактивирует биологическую активность 24-эпибрассинолида или флавоноидов, предполагая, что растения, как и животные, используют добавление сульфогруппы для регулирования запасов этих вторичных метаболитов (Hashiguchi et al., 2013, 2014; Руло и др., 1999).

После выделения сульфата холестерина из морской звезды Asterias rubens (Björkman, Karlsson, & Nilsson, 1972; Godfellow & Goad, 1973) было также описано несколько сульфатированных стеролов из широкого круга морских организмов, особенно из губок ( Aiello, Fattorusso, & Menna, 1999) и иглокожих (D’Auria, Fontana, Minale, & Riccio, 1990). Некоторые из этих молекул обладают широким спектром биологической активности и потенциального терапевтического применения.Особо следует отметить их активность против ВИЧ-1 (Tziveleka, Vagias, & Roussis, 2003) и патогенных грибков (Boonlarppradab & Faulkner, 2007; DiGirolamo, Li, Jacob, Clark, & Ferreira, 2009). Последние сообщения включают модуляцию рецепторов или регуляторных белков, таких как сиртуины (Nakamura et al., 2018), протеинкиназа Cζ (Whitson et al., 2009, 2008), прегнан-X-рецептор (Festa et al., 2011), и фарнезоид-Х-рецептор (Sepe et al., 2011).

Как микробиота кишечника человека преодолевает проблему сульфатации, вызванную гликозаминогликанами

Значение

Основными питательными веществами, доступными для микробиоты человека, являются сложные углеводы.Гликаны-хозяева важны для этого микробного сообщества, особенно при дефиците пищевых углеводов. Гликаны-хозяева гепарин и гепарансульфат являются высокоприоритетными углеводами для Bacteroides thetaiotaomicron , члена микробиоты человека. Деградация этих сложных углеводов является сложной задачей, что отражает их весьма изменчивые модели сульфатирования. Как бактерии приспособились к деполимеризации множества субструктур этого важного класса гликозаминогликанов, неизвестно.Здесь мы показываем, как ферментные консорциумы, демонстрирующие дополнительные функции, нацелены на различные свойства этих гликанов хозяина. Структурные данные показывают, что кислотные группы гликанов являются ключевыми детерминантами специфичности для ферментов и связывающих белков, составляющих аппарат деградации.

Abstract

Микробиота человека, играющая важную роль в поддержании здоровья и развитии болезней, использует сложные углеводы в качестве основного источника питательных веществ. Иерархия использования указывает на то, что гликозаминогликаны хозяина гепарин (Hep) и гепарансульфат (HS) являются высокоприоритетными углеводами для Bacteroides thetaiotaomicron , видного члена микробиоты человека.Паттерны сульфатирования этих гликозаминогликанов сильно различаются, что представляет значительную ферментативную проблему для полисахаридлиаз и сульфатаз, которые опосредуют деградацию. Возможно, что бактерия рекрутирует лиазы с высокой пластической специфичностью и экспрессирует репертуар ферментов, нацеленных на субструктуры гликозаминогликанов с переменной сульфатацией, или что гликаны десульфатируются перед расщеплением лиазами. Чтобы различать эти механизмы, компоненты B.аппарат для разложения Hep/HS thetaiotaomicron . Данные показали, что бактерия экспрессирует одноповерхностную эндо-действующую лиазу, которая расщепляет HS, что отражает ее более высокую молекулярную массу по сравнению с Hep. Олигосахариды Hep и HS, импортированные в периплазму, расщеплялись репертуаром лиаз, причем каждый фермент проявлял специфичность к субструктурам внутри этих гликозаминогликанов, проявляющих различную степень сульфатирования. Более того, кристаллические структуры ключевого белка, связывающего поверхностный гликан, который способен связывать как Hep, так и HS, а также периплазматические сульфатазы обнаруживают основные детерминанты специфичности для этих белков.Описанный здесь локус высоко консервативен в кишечнике человека Bacteroides , что указывает на то, что разработанная модель имеет общее отношение к этому важному микробному сообществу.

Микробиота толстой кишки человека (КМ) имеет решающее значение для здоровья (1⇓–3). Состав CM зависит от его способности получать доступ к питательным веществам, которые в первую очередь представляют собой диетические гликаны и гликаны хозяина. Анализ механизмов, с помощью которых сложные углеводы используются CM, имеет решающее значение для понимания движущих сил экологии этого микробного сообщества и того, как этот процесс связан со здоровьем человека.

Основными разрушителями гликанов в CM являются Bacteroidetes (4⇓–6). Эти организмы получают доступ к своим целевым полисахаридам посредством эндодействующих ферментов на бактериальной поверхности с последующим импортом образовавшихся олигосахаридов, которые деполимеризуются в периплазме. Гены, кодирующие эти ферментные системы, физически связаны в локусы, называемые локусами утилизации полисахаридов (PUL) (7). Значительная часть сложных углеводов, доступных для КМ, имеет происхождение от млекопитающих (4).Несмотря на это знание, наше понимание того, как CM получает доступ к гликанам хозяина/млекопитающих, фрагментарно. Были предложены модели разрушения высокоманнозных и сложных N -гликанов кишечником Bacteroides (8), и установлено экологическое значение удаления терминальной сиаловой кислоты из эпителиальной слизистой оболочки (9). Однако существует недостаток информации о механизме, посредством которого гликозаминогликаны (ГАГ), такие как гепарин (Гепарин) и гепарансульфат (ГС), используются КМ.HS является основным компонентом внеклеточного матрикса клеток млекопитающих и, следовательно, может быть доступен для кишечной микробиоты посредством оборота эпителиальных клеток, тогда как Hep высвобождается из тучных клеток в местах повреждения и, следовательно, может быть не таким распространенным, как HS. в кишечнике (10, 11).

Микробное использование Hep и HS создает серьезные биологические проблемы. Оба гликана значительно различаются по степени полимеризации (DP), что позволяет предположить, что деградация может происходить в разных клеточных местах, тогда как характер сульфатирования и уроновая кислота (UA) также различаются (рис.1) (10). Эта существенная гетерогенность указывает на то, что либо требуется сложный набор ферментов для деконструкции этих кислых гликанов, либо ферменты, которые опосредуют этот процесс, обнаруживают значительную неразборчивость субстрата. Деполимеризация UA-содержащих гликанов, таких как Hep/HS, опосредуется гликозидгидролазами (GH) и/или полисахаридлиазами (PL), которые сгруппированы в семейства на основе последовательностей в базе данных CAZy (12). Hep/HS разлагаются бактериальными PL, принадлежащими к семействам PL12, -13 и -21.На основании специфичности эти PL можно разделить на три функциональные группы: Hep I–III. Лиазы Hep I требуют сульфатирования, PL Hep II проявляют неразборчивость в отношении паттернов сульфатирования, а ферменты Hep III расщепляют низкосульфатированные области этих GAG (13, 14). Лиазы генерируют продукты, кэпированные Δ4,5-ненасыщенной UA, которая высвобождается из GAG под действием GH семейства GH88 (13). Кроме того, были охарактеризованы некоторые ГАГ-специфические сульфатазы (15).

Рис. 1.

Модель деградации Hep и HS под действием Bt .( A ) Схема локуса PUL Hep в Bt . ИМ, внутренняя мембрана. ( B ) Схематическое представление клеточной локализации, активности и специфичности ферментов, кодируемых PUL Hep , и белков, связывающих гликаны. Показана типичная структура ГС. Белки, для которых в данной работе определена рентгеноструктурная структура, представлены уменьшенными изображениями структуры.

Хотя ферменты, активные против Hep и HS, были описаны, неясно, как эти PL, GH и сульфатазы действуют в унисон для решения проблемы сульфатирования, создаваемой этими GAG.Можно предложить несколько сценариев, в том числе десульфатацию перед расщеплением скелета, использование PL широкой специфичности, которые могут расщеплять Hep и HS независимо от их сульфатирования, или привлечение консорциума лиаз, где каждый фермент нацелен на определенные субструктуры в этих GAG, которые различаются по их сульфатный профиль. Точно так же неизвестны механизмы, с помощью которых гликан-связывающие белки клеточной поверхности (SGBPs), которые вносят вклад в механизм деградации гликанов, нацелены на консервативные свойства этих гетерогенных гликанов.

Bacteroides thetaiotaomicron ( Bt ), член CM, использует Hep и HS в качестве высокоприоритетных источников питательных веществ, которые активируют один PUL (PUL Hep ) (16). Здесь мы рассмотрели механизм, с помощью которого ферменты и связывающие белки, кодируемые этим локусом, полностью деконструируют эти высоковариабельные GAG и, таким образом, решают проблему сульфатирования. Кристаллические структуры ключевых белков обеспечивают понимание механизма распознавания субстрата и лиганда. Данные показали, как оптимизируется специфичность аппарата для нацеливания на репертуар структур ГАГ, представляемых бактериям на разных стадиях процесса деградации.

Результаты

Структура HS и Hep.

Hep и HS состоят из дисахаридного повторяющегося звена, состоящего из UA, d-глюкуроновой (GlcA) или l-идуроновой кислоты (IdoA), чередующихся с d-глюкозамином (GlcN). GlcN связан α1,4 с UA, тогда как IdoA и GlcA связаны α1,4 и β1,4 соответственно с аминосахаром (10) (рис. 1). GlcN может сульфатироваться на O6 и сульфатироваться или ацетилироваться на N2 (GlcNAc), тогда как UA часто сульфатируются на O2. Hep содержит значительно больше IdoA, чем HS, и почти полностью сульфатирован, в то время как HS различается по своей картине сульфатирования, включая области с высокой степенью сульфатации (подобные Hep) и области с небольшим содержанием сульфата или без него (рис.1). СП Hep (∼40) существенно меньше, чем у HS (∼80–200).

PUL

Hep Структура.

Bt растет на Hep, HS и N -ацетил-де- O -сульфатированном гепарине (ΔSHep) (рис. S1) (16, 17). Транскриптомика Bt , культивируемого на Hep, показывает, что только PUL Hep , простирающийся от bt4652 до bt4675 , повышался в ответ на этот GAG (16). Локус кодирует PL, сульфатазы, GH88 и член семейства репрессоров ORF, киназ (ROK; Pfam PF00480) (рис.1). Кроме того, сульфатаза BT1596 также активируется Hep (15). PUL Hep кодирует единственную SusC/SusD-подобную транспортную систему гликанов наружной мембраны и потенциальный SGBP (Fig. 1). In silico анализ встречаемости PUL Hep предполагает, что он широко распространен среди Bacteroides и сохраняет высокую консервативность последовательности и синтению (рис. S2).

Рис. S1.

Рост WT и мутантных штаммов Bt на Hep, HS и ΔSHep. ( A ) Мутантные штаммы с делециями в белках, связывающих гликан PULHep BT4661 и BT4659. Слева , Врезка показывает рост на олигосахаридах гепарина. ( B ) BT4662 PL12 одиночные и BT4662 PL12/BT4652 PL15 двойные мутантные штаммы. ( C ) Мутантный штамм BT4652 PL15. ( D ) BT4657 PL12 одиночные и BT4657/BT4652 PL15 двойные мутантные штаммы. ( E ) BT4675 PL13 одиночные и BT4675 PL13/BT4652 PL 15 двойные мутантные штаммы. ( F ) Мутантные штаммы BT4655 NS сульфатазы и BT4654 GlcNAc киназы. Все выращивания проводили в ММ с добавлением 10 мг/мл соответствующего полисахарида.Измерения OD 600 проводили каждые 20 минут после бактериальной инокуляции с помощью планшетного ридера.

Рис. S2.

PUL Hep дистрибутив и синтений. Гены представлены над или под каркасом (жирная линия), чтобы отличить кодирующий штамм. Большое расстояние между крайним левым PL13-кодирующим геном, отделенным 5–20 генами от основной области PUL, обозначено двойной косой чертой, прерывающей каркасы. Гомологичные белки у видов с похожей модульной структурой PUL соединены серыми трапециями.Названия видов указаны справа. PUL 1 и 2 используются для обозначения дискретных, но похожих PUL в пределах одного и того же вида.

ПГГ.

Внеклеточное расположение предполагаемого SGBP, BT4661, было выявлено с помощью иммунофлуоресценции и обработки протеиназой К с использованием антител против белка (рис. S3 A и B ). Иммунопреципитация BT4661 из клеток, выращенных на Hep, с последующим вестерн-блоттингом выявила присутствие BT4659 SusD-подобного , что указывает на то, что два белка физически связаны (фиг.S3 С ). Взаимодействие между кодируемым PUL SGBP и SusD-подобным согласуется с предыдущими данными по системе утилизации крахмала Bt (18). Важность BT4659 SusD-подобного в утилизации Hep/HS была подчеркнута серьезной задержкой (> 20 ч), продемонстрированной ∆ bt4659 SusD-подобным на этих GAG (рис. S1 A ). Напротив, ∆ bt4661 SGBP не имел дефектов роста на HS или ΔSHep, но имел заметный фенотип при выращивании на олигосахаридах, полученных из Hep (рис.S1 A , Вставка ). Эти данные предполагают, что SGBP играет роль в удалении олигосахаридов, а не в приобретении полисахаридов, как это наблюдается в Bacteroides ovatus -опосредованной деградации ксилоглюкана (19).

Рис. S3.

Клеточная локализация белков, кодируемых PUL Hep , кривые SAXS и ключевые связывающие остатки BT4661 SGBP и сравнение активных центров сульфатаз со структурными гомологами. ( A ) Иммунофлуоресцентное мечение выращенных Glc клеток WT или ∆BT4661 с помощью ( Left ) анти-4661 антитела или ( Right ) фазового контраста.( B ) Вестерн-блоты, показывающие целые клетки, выращенные на Hep, обработанные протеиназой K и зондированные поликлональными антителами, выработанными против рекомбинантных форм BT4661 SGBP , BT4662 PL12 и BT4657 PL12 . Протеиназа К не может пересекать внешнюю мембрану и, следовательно, может действовать только на белки, расположенные на поверхности, показывая, что BT4661 SGBP и BT4662 PL12 расположены на поверхности, тогда как BT4657 PL12 , скорее всего, периплазматические. ( C ) Co-IP BT4661 SGBP и BT4659 SusD-подобного из лизата клеток, выращенных Hep, с использованием поликлонального антитела против BT4461, иммобилизованного на агарозных шариках.ИП, иммунопреципитация. ( D ) Экспериментальные кривые SAXS и подобранные профили рассеяния, рассчитанные GASBOR. Объединенные экспериментальные данные показаны в виде серых треугольников (лиганды BT4661 SGBP ) или синих кружков (апо BT4661 SGBP ). Кривые рассеяния, подобранные с помощью GASBOR, показаны сплошными линиями. lnl — логарифмическое представление интенсивности; q , угол рассеяния в ангстремах −1 . ( E ) Аффинный гель-электрофорез BT4661 SGBP аланиновых мутантов остатков, которые взаимодействуют с полностью сульфатированным гексасахаридным лигандом Hep. Верхний показывает нативный гель без добавления лиганда, а Нижний показывает нативный гель с добавлением Hep (конечный результат 0,1%). Потеря замедления K505A, R581A и R582A на геле Hep показывает, что эти остатки имеют решающее значение для распознавания лиганда. ( F ) Наложение BT4656 6S-sulf (зеленый), человеческой галактозамин-6-сульфатазы (идентификационный код PDB 4FDI; пурпурный) и BT1596 2S-sulf (голубой), показывающее сохранение в каталитическом центре . Показанные сульфатные группы связаны с BT4656 6S-sulf и BT1596 2S-sulf , тогда как ионы кальция связаны с BT4656 6S-sulf и 4FDI.Обратите внимание, что остаток 89 в 4FDI представляет собой формилглицин (FG). ( G ) Наложение BT4656 6S-sulf со связанным GlcNS6S (зеленый), 4FDI (пурпурный) и BT1596 2S-sulf со связанным 4,5UA2S-GlcNS6S (голубой), демонстрирующее вариабельность в области связывания гликона . Для ясности показан только сахар, взаимодействующий с белком.

Гликановая специфичность.

Изотермическая титрационная калориметрия (ITC) (рис. 2 A и таблица S1) показала, что BT4661 SGBP тесно связывается как с Hep, так и с HS ( K d ∼ 3 мкМ), но не связывается с другими GAG. .Примечательно, что покрытие обоих GAG было одинаковым, что позволяет предположить, что белок может переносить как сульфатированные, так и несульфатированные области и может взаимодействовать или приспосабливаться к различным UA и нейтральным сахарам в Hep и HS (рис. 1). BT4661 SGBP связывается с олигосахаридами с DP ≥ 4, при этом аффинность увеличивается до DP = 6 до уровня, аналогичного Hep. Эти данные показывают, что сайт связывания BT4661 SGBP может вмещать гексасахарид и поддерживает способность SGBP переносить/распознавать сульфатирование и IdoA во всех субсайтах (таблица S1).Эти данные показывают, что BT4661 SGBP представляет собой SGBP аппарата для деградации Hep/HS и что этот белок может вмещать ряд структур GAG на основе Hep.

Рис. 2.

Структурная и биохимическая характеристика PUL Hep -кодированного SGBP BT4661. ( A ) Следы ITC для ( Верхний ) BT4661 SGBP и ( Нижний ) BT4659 SusD-подобный против HS и Hep. ( B ) Мультяшное изображение BT4661 SGBP , окрашенное от синего к красному от конца N до конца C.Каждый из шести дискретных доменов помечен. Серые сферы показывают положение междоменных пролинов. ( C ) Конверты SAXS (серая сетка) для ( Верхний ) apoBT4661 SGBP и ( Нижний ) BT4661 SGBP + Hep. Наилучшее соответствие кристаллической структуры BT4661 SGBP (окрашено от синего к красному от N-конца к C-концу) показано внутри конвертов SAXS. ( D ) Карта 2Fo-Fc с контуром 1,0 сигма для полностью сульфатированного гексасахарида Hep в комплексе с BT4661 SGBP .( E ) Структура C-концевых доменов D5 и D6 BT4661 SGBP , связанного с гексасахаридом Hep (углероды в виде желтых палочек). ( F ) Сайт связывания лиганда BT4661 SGBP , связанного с полностью сульфатированным гексасахаридом Hep. Боковые цепи аминокислот показаны зеленым цветом, сахара — желтым, а Н-связи между лигандом и белком — черными пунктирными линиями. Остатки, отмеченные красным, имеют решающее значение для распознавания лиганда. Шесть субсайтов связывания сахара помечены от одного до шести от восстанавливающего конца олигосахарида.

Таблица S1.

ITC Данные для BT4659 SUSD-ALECT и BT4661 SGBP

BT4659

BT4659 SUSD-ALECT связаны HEP, HS и ΔShep с аналогичным аффинностью, но K D было ~ 20-30- раза ниже, чем у BT4661 SGBP . Ранее сообщалось о различиях в аффинности между SusD-подобным и родственным SGBP, и они могут отражать предполагаемые различные роли, которые эти белки играют в утилизации гликанов (5, 19).

Структура полной длины BT4661
SGBP .

Кристаллическая структура BT4661 SGBP (таблица S2) выявила шесть дискретных доменов, которые принимают Ig-подобную складку (рис. 2 B ). Эта мульти-Ig-подобная доменная структура является общей для трех других SGBP, которые имеют известные структуры, хотя между этими белками очевидна небольшая идентичность последовательностей или ее отсутствие (5, 19, 20). Домены, определенные как от D1 (N-конец) до D6 (C-конец), расположены в вытянутой изогнутой конформации. Междоменные остатки пролина могут ограничивать гибкость SGBP (19).Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (МУРР) на полноразмерном BT4661 SGBP в присутствии и в отсутствие Hep дало одинаковые значения R g и D max для обоих условий (таблица S3). , что указывает на то, что ГАГ-мишень не вызывает значительных конформационных изменений (рис. 2 C , SI Results и рис. S3 D ).

Таблица S3.

Экспериментальный радиус вращения ( R g ), интенсивность рассеяния вперед [ I (0)] и максимальные значения расстояний ( D max ), извлеченные из кривых SAXS и BT46661 + лиганд (BT4661L)

Структура усеченного BT4661
SGBP , связанного с олигосахаридом.

Попытки получить лигандный комплекс полноразмерного BT4661 не увенчались успехом. Укороченная форма белка, содержащая только D5 и D6, демонстрировала сходное связывание лиганда с SGBP дикого типа. Кристаллическую структуру производного D5/6 (TrBT4661 SGBP ) определяли в комплексе с полностью сульфатированным ненасыщенным гексасахаридом, полученным из Hep (∆4,5UA2S-GlcNS6S-IdoA2S-GlcN6S-IdoA2S-GlcNS6S) (рис. 2 ). D–F и таблицу S2). Сайт связывания формируется между доменами D5 и D6, при этом восстанавливающий конец гексасахарида, GlcNS6S, лежит в D6 (субсайт 1), а невосстанавливающий конец ∆UA2S расположен в D5 (субсайт 6).D6 и D5 содержат сахара 1–4 и 5 и 6 гексасахарида соответственно. Присутствие сайта связывания гликана на С-концевом домене расширенного мультидоменного SGBP наблюдалось ранее и может быть адаптацией, обеспечивающей связывание лиганда на расстоянии от клеточной поверхности (19). Подобно другим GAG-связывающим белкам, взаимодействия между лигандом и белком в основном связаны с основными аминокислотами, а не с ароматическими остатками, что является характерным признаком белково-углеводного узнавания нейтральных гликанов (10, 19⇓-21).Сканирующий аланин мутагенез показал, что K505, R581 и R582 являются ключевыми остатками, участвующими в связывании лиганда (рис. S3 E ). R582 и K505 взаимодействуют с карбоксилатами UA в субсайтах 2 и 6 соответственно, тогда как R581 взаимодействует с O3 восстанавливающего концевого сахара. Эти взаимодействия будут сохраняться во всех GAG на основе Hep, что объясняет способность BT4661 распознавать как HS, так и Hep с одинаковой аффинностью.

Ферменты, кодируемые PUL

Hep .

Активность сульфатаз ФЛ и ГР, кодируемых PUL Hep , определяли на различных субстратах и ​​оценивали рост мутантных штаммов, лишенных активных форм этих ферментов, на Hep, HS и ΔSHep (рис. S1 B– Ф ).

Поверхностная лиаза BT4662
PL12 .

Было показано, что липопротеин BT4662 PL12 является поверхностным ферментом (рис. S3 B ), который активен в отношении Hep, ∆SHep и HS, с предпочтением последнего субстрата (рис.3 A и Таблица S4). Аэробные анализы цельных клеток, которые сообщают только об активности поверхностных ферментов, показали, что структура продуктов реакции точно соответствует таковой у рекомбинантного BT4662 PL12 (рис. S4 A ), подтверждая клеточное расположение PL. Ряд олигосахаридов, образующихся на ранних стадиях деградации ГАГ, указывает на эндоактивность (рис. 3 A и рис. S4 E ). В других охарактеризованных PUL поверхностная эндо-действующая гликаназа играет ключевую роль в утилизации полисахаридов, генерируя олигосахариды соответствующего размера для транспорта с помощью SusC/D-подобного аппарата (5).Однако мутант ∆bt4662 PL12 Bt показал только частичный дефект роста на HS (рис. S1 B ), вероятно, отражающий гетерогенность DP GAG; таким образом, более мелкие формы этого гликана могли транспортироваться в периплазму Bt без необходимости предварительной деполимеризации. Рост на Hep и ∆SHep не был нарушен у мутанта ∆bt4662 PL12 , что отражает их низкую DP, которая, вероятно, позволяет этим молекулам транспортироваться в периплазму без предварительной ферментативной обработки.

Рис. 3.

Профиль продукта PUL Hep -кодированных PL против Hep, HS и ΔSHep. ( A ) BT4662, ( B ) BT4657, ( C ) BT4675 и ( D ) BT4652. Пики идентифицировали путем сравнения с известными стандартами при A 235 . Черные линии представляют нулевые временные точки, тогда как синие, зеленые и красные линии представляют собой ранние, средние и поздние точки соответственно во времени реакции для каждого фермента.

Таблица S4.

Каталитическая активность PUL Hep -кодируемых PL

Рис.С4.

Активность целых клеток и рекомбинантных ферментов PUL Hep против Hep и олигосахаридов Hep и свидетельство того, что BT4655 является сульфаминидазой. ( A ) Активность целых клеток и рекомбинантных лизаз (0,1 мкМ) против Hep (10 мг/мл). Top показывает клетки, выращенные на Glc или Hep в качестве единственного источника углерода, до среднеэкспоненциальной фазы, промытые и протестированные против Hep для определения активности поверхностных ферментов. Средний и Нижний представляют собой продукты, высвобождаемые рекомбинантными формами различных кодируемых PUL лиаз против Hep.Di и Tet представляют собой стандарты дисахарида Hep и тетрасахарида соответственно (структуры 2 и 5 соответственно в B ). ( B ) Идентификация сахаров , маркированных в C и D . ( C ) Хроматограммы, показывающие устойчивость к сульфатам BT4657 PL12 по сравнению с 4, сульфатированным тетрасахаридом, в котором отсутствует одно сульфатирование O2, и 5, полностью сульфатированным тетрасахаридом, до и после добавления BT1596 2S-sulf . ( D ) Хроматограммы, демонстрирующие экзопроцессивность BT4652 PL15 в отношении олигосахаридов Hep (все при 50 мкМ субстрата).( E ) ТСХ-анализ профилей продуктов BT4662 PL12 и BT4657 PL12 в зависимости от ΔSHep (10 мг/мл). ( F ) Супернатанты стационарной фазы клеток WT и ΔBT4655 NS-Sulf , выращенных на Hep. Полоса GlcNS является стандартной.

Анализы конечных точек показали, что Hep был почти полностью недоступен для BT4662 PL12 (разложение всего ~5%), тогда как значения деполимеризации HS и ΔSHep составляли ~40 и ~80% соответственно (таблица S5). По отношению к HS предельные продукты включали широкий спектр продуктов, тогда как полная деградация ∆SHep приводила к образованию олигосахаридов с СП 2–10 (рис.3 A и рис. S4 E ). BT4662 PL12 был активен только в отношении олигосахаридов Hep с DP ≥ 10 (таблица S4). Эти данные предполагают, что BT4662 PL12 имеет большую щель, связывающую субстрат, в которой сульфатные группы могут размещаться только в определенных положениях, и фермент проявляет эндо-способ действия с ограниченной процессивностью. Эти данные согласуются с ролью фермента в деполимеризации высокомолекулярных ГАГ, таких как HS, на поверхности бактерий.

Таблица S5.

Анализ конечной точки лиазы

Периплазматические PL.

На основании обработки протеиназой К и профилей продуктов цельноклеточных анализов по сравнению с рекомбинантными ферментами, большинство расщепляющих полисахариды ферментов, кодируемых PUL Hep , расположены в периплазме (рис. S3 B и S4 A ) и не обнаруживают признаков зависимости от металлов. Объединяющей чертой трех периплазматических PL, BT4652 PL15 , BT4657 PL12 и BT4675 PL13 , является появление предельных дисахаридных продуктов в начальной фазе деградации (рис.3 B–D ). Эта активность указывает на степень процессивности и, вероятно, приводит к быстрой продукции дисахаридов, которые действуют как сигнальные сигналы, необходимые для активации PUL hep (17). Три периплазматические лиазы имеют разные предпочтения в отношении Hep, HS и ΔSHep (подробно описаны ниже), что отражает способность Bt использовать эти три субстрата.

BT4657 PL12 проявляли наибольшую активность против HS и могли получить доступ к ~50% полимера; в то время как против Hep лиаза расщепляла 27% гликозидных связей (таблицы S4 и S5).Фермент полностью расщепил ΔSHep до одного несульфатированного дисахарида (рис. 3 B и таблицы S4 и S5). Во время начальной деградации ΔSHep BT4657 PL12 генерировал ряд олигосахаридов, причем дисахарид был доминирующим продуктом (рис. 3 B и рис. S4 E ). Эти данные указывают на то, что BT4657 PL12 преимущественно эндо-действующий, с определенной степенью процессивности. Продукты, полученные из частично сульфатированных олигосахаридов, показали, что BT4657 PL12 не может приспособиться к 2- O сульфатированию UA в своем активном центре (+1 субсайт), что объясняет, почему фермент проявлял ограниченную активность против Hep ( SI Results ). .

Напротив, BT4675 PL13 демонстрировал самую высокую активность в отношении Hep и был неактивен в отношении ΔSHep, что согласуется с предыдущим исследованием, предполагающим, что для активности требуется сульфатирование (таблица S4) (22). Требование сульфатирования было отражено в анализах конечной точки, которые показали почти полное переваривание Hep, но только ~50% HS (таблица S5). Фермент PL13 генерировал ряд продуктов разного размера, указывающих на эндо-способ действия, но также проявлял значительную процессивность, поскольку UA2S-GlcNS6S был доминирующим продуктом в начале реакции (рис.3 С ).

Ранее было показано, что ферменты PL15 представляют собой только альгинат-лиазы (23). Однако BT4652 PL15 был активен на всех трех протестированных ГАГ. Фермент был примерно в 800 раз более активен в отношении полностью сульфатированных олигосахаридов Hep по сравнению с ΔSHep, что указывает на то, что сульфатирование является ключевым для оптимальной активности (таблица S4), что согласуется с продукцией UA2S-GlcNS6S, UA2S-GlcNS и UA-GlcNS6S из Hep. ; однако на фоне HS образуется дополнительный дисахарид UA-GlcNAc6S, а несульфатированный дисахарид UA-GlcNAc образуется только из ΔSHep (рис.3 Д ). BT4652 PL15 генерировал дисахариды против всех субстратов; во время начальной деградации промежуточных продуктов не наблюдалось (рис. 3 D и рис. S4 D ). Эти данные указывают на то, что фермент является исключительно экзопроцессивным и может размещать сульфаты во всех положениях субстрата. Хотя сульфатирование не является существенным, оно является определяющим фактором специфичности, и поэтому BT4652 PL15 демонстрирует большую гибкость субстрата, чем BT4675 PL13 .

Данные, описанные выше, позволяют предположить, что BT4652 PL15 и BT4675 PL13 могут нацеливаться на аналогичные сильно O -сульфатированные области Hep и HS, хотя фермент PL15 может, кроме того, расщеплять редко сульфатированные области этих GAG. С этой точкой зрения согласуется наблюдение, что мутантные штаммы, лишенные BT4652 PL15 или BT4675 PL13 , обнаруживают дефекты роста Hep и, в меньшей степени, HS, но не ΔSHep (рис. S1 B-E ). Ростовые свойства Δbt4657 PL12 выявили значительную роль BT4657 PL12 в деградации HS.Эндо-действующая лиаза, вероятно, расщепляет области с низким уровнем сульфатирования, создавая невосстанавливающие концы, на которые нацелены BT4652 PL15 и BT4675 PL13 . Таким образом, наши данные обеспечивают биологический контекст для множественных лиаз, экспрессируемых Bt в ответ на Hep и HS ( Обсуждение ). Первичными субстратами для BT4675 PL13 и BT4657 PL12 являются области ГАГ, которые были сильно и слабо сульфатированы соответственно. Δbt4652 ΔBT4652 PL15 штамм имел наибольший дефект роста на HEP, тогда как ΔBT4652 / ΔBT4657 PL12 PL12 отображается мало роста на HS и заметное увеличение лаг-фаза при культивировании на ΔSHep (рис.S1 D ). Эти профили роста предполагают, что BT4657 PL12 и BT4675 PL13 продуцируют олигосахариды, которые могут разлагаться только BT4652 PL15 , и, таким образом, дополнительная гибкость в распознавании PL15 связывает две взаимодополняющие активности ферментов PL12 и PL13 (обсуждается в подробно ниже).

Фермент GH88.

BT4658 GH88 принадлежит к семейству ферментов, расщепляющих гликозидную связь между ∆4,5-ненасыщенными UA и дисахаридами GlcN/GlcNAc, которые продуцируются GAG-лиазами.Фермент не был активен при сульфатировании O2 UA, но мог приспосабливаться к сульфатированию при N2 или O6 нейтрального сахара, отражая специфичность связывания гибридной двухкомпонентной системы (HTCS) PUL Hep (HTCS) BT4663 (таблица S6) (17). ). Настройка специфичности фермента GH88 по сравнению с его родственным HTCS аналогична наблюдаемой в PUL хондроитинсульфата Bt , что указывает на консервативную роль этих ферментов в контроле скорости деградации сигнала во время роста на GAG (24). .Хотя BT4658 GH88 продемонстрировал аналогичную каталитическую эффективность в отношении GlcNS и GlcNAc, K m и k cat для сульфатного сахара были ниже, что позволяет предположить, что N способствует связыванию с субстратом, но способствует связыванию с субстратом. вылет товара, что привело к сокращению k cat .

Таблица S6.

Каталитическая активность кодируемых PUL Hep O -сульфатаз, GH88 и киназы ROK

O- сульфатаз.

Предыдущее исследование показало, что BT1596 2S-sulf и BT4656 6S-sulf являются экзо-действующими O -сульфатазами; BT1596 2S-sulf нацелен на сульфатирование O2 ненасыщенной UA на невосстанавливающем конце ди- и олигосахаридов, тогда как BT4656 6S-sulf расщепляет O6-сульфат моносахарида GlcNAc6S или GlcNS6S, но неактивен в отношении GalNAc6S (таблица S6S). (15). Для изучения механизма распознавания субстрата были определены кристаллические структуры неактивных форм двух Bt O -сульфатаз в комплексе с их субстратами.

BT1596 2S-sulf и BT4656 6S-sulf имеют общую консервативную α/β-гидролазную складку, состоящую из одного домена (рис. 4, , верхний и таблица S2). Оба фермента имеют карманную топологию с сайтами связывания металлов, расположенными в основании кармана. Кальций был смоделирован в связанной с лигандом структуре BT4656 6S-sulf , тогда как в BT1596 2S-sulf металл не наблюдался (рис. 4, Lower ). Замена аланином остатков в этом кармане инактивировала оба фермента, выявив местонахождение активного центра ( SI, результаты и таблица S6).

Рис. 4.

Сульфатазные структуры. Верхний показывает мультяшные изображения ( A ) BT1596 2S-sulf и ( B ) BT4656 6S-sulf . Карты 2Fo-Fc с контуром 1,0 сигма для Δ4,5UA2Sβ1–4GlcNS6S в комплексе с BT1596 2S-sulf и GlcNS6S в комплексе с BT4656 6S-sulf показаны в активных сайтах соответствующих ферментов. Нижний показывает палочки взаимодействия активного центра между ( A ) BT1596 2S-sulf и Δ4,5UA2Sβ1–4GlcNS6S и ( B ) BT4656 6S-sulf и GlcNS64.Боковые цепи аминокислот показаны зеленым цветом, сахара — желтым, а Н-связи между сахаром и белком — черными пунктирными линиями. Остатки, отмеченные красным, являются ключевыми каталитическими аминокислотами.

Неактивные формы BT1596 2S-sulf и BT4656 6S-sulf сокристаллизовали с ∆UA2S-GlcNS6S и GlcNS6S соответственно (рис. 4). BT1596 2S-sulf и BT4656 6S-sulf были неактивны при экспрессии в Escherichia coli , потому что кишечная бактерия не может превращать S64 и S77, соответственно, в формилглицин, который действует как каталитический нуклеофил [для образования формилглицина в Э.coli , каталитический серин был мутирован в цистеин, потому что бактерия может превращать цистеин в формилглицин (25)]. Эссенциальные гистидины h288 в BT1596 2S-sulf и h296 в BT4656 6S-sulf находятся в непосредственной близости от разрывной связи (рис. 4, Lower и таблица S6). Таким образом, h288 и h296 являются идеальными кандидатами в качестве каталитической кислоты, необходимой для протонирования O2/O6 уходящего сахара после нуклеофильной атаки формилглицином и образования промежуточного соединения сульфат-фермент, которое затем расщепляется посредством β-элиминирования до завершить каталитический цикл.

В BT1596 2S-sulf карбоксилат ∆UA2S вступает в бидентатно-ионное взаимодействие с R237, и потеря этого взаимодействия (R237A) приводит к снижению каталитической эффективности в 2000 раз (рис. 4 A и табл. С6). Это взаимодействие, вероятно, является основной детерминантой специфичности, используемой ферментом, и объясняет, почему сульфатаза действует на дисахариды хондроитина, которые также содержат O2-сульфатированную UA. В BT4656 6S-sulf R363 и D361 координируют O4, а мутация R363 в Ala вызывает примерно 500-кратное снижение активности, тогда как D361A был неактивен (таблица S6).Эти аминокислоты, вероятно, являются детерминантами специфичности субстратов с конфигурацией глюко-поверх-галактоза. ( SI Results содержит описание всех мутантов.)

N- сульфатаза.

Прогнозируемых сульфамидаз в PUL Hep нет; однако GlcNS не накапливается во время роста на Hep, что указывает на то, что Bt использует этот сахар (рис. S4 F ). Мы удалили оставшуюся неохарактеризованную ORF в PUL Hep , bt4655 . Этот мутант демонстрировал дефект роста на сульфатированных ГАГ, а GlcNS накапливался в среде во время роста на Hep (рис.S1 F и S4 F ). Эти данные показывают, что BT4655 расщепляет сульфаматную связь и представляет собой ранее не охарактеризованный класс сульфатаз. К сожалению, предполагаемая роль BT4655 как сульфамидазы не может быть подтверждена биохимически, поскольку не может быть получена растворимая рекомбинантная форма белка.

Данные показывают, что три сульфатазы являются ключевыми для распада как Hep, так и HS. BT1596 2S-sulf действует первым, удаляя 2-O сульфатирование предельного дисахарида, производного от PL, и позволяя BT4658 GH88 гидролизовать свою целевую связь, поскольку этот фермент не использует 2-O-сульфатированные субстраты.Затем сульфатированные моносахариды глюкозамина являются субстратами для BT4656 6S-sulf и, вероятно, сульфамидазы BT4655 (таблица S6).

Цитоплазматическая сахаркиназа.

BT4654 ROK является цитоплазматическим членом семейства белков ROK, который обладает консервативным мотивом DxGxT и, таким образом, вероятно, является АТФ-зависимой киназой (26). Эта активность была подтверждена способностью фермента фосфорилировать глюко- и манно-конфигурированные субстраты, но не галакто-конфигурированные сахара (таблица S6). k cat / K m фермента уменьшилось с GlcN > GlcNAc >> Glc/Man >> GlcNS, что было обусловлено увеличением K m (таблица S6). Эти данные показывают, что O4 имеет решающее значение для катализа, в то время как сильный отбор по сродству осуществляется при C2 для экваториального амина, указывая на то, что BT4654 ROK использует как экваториальный N2, так и O4 в качестве детерминант специфичности. Поскольку мутант ∆bt4654 ROK не обнаруживал дефектов роста на Hep или HS (рис.S1 F ), Bt , по-видимому, проявляет избыточность в фосфорилировании GlcN и GlcNAc.

Результаты SI

Анализ данных SAXS.

Значения радиусов инерции ( R g ) получены из приближения Гинье (37): 2 R g 2 /3), где I ( q ) — интенсивность рассеяния, а I (0) — интенсивность рассеяния вперед.Радиус вращения и I (0) выводятся из наклона и пересечения, соответственно, линейной аппроксимации Ln [ I ( q )] против q 2 8 в диапазоне q q⋅R g < 1,3. Функция распределения расстояний P ( r ) была рассчитана на объединенной кривой путем обращения Фурье интенсивности рассеяния I ( q ) с использованием GNOM (38).Все кривые рассеяния свидетельствовали о мономерных состояниях молекул в растворе. Однако концентрационная зависимость величины R g в области низких q (табл. S3) свидетельствовала о слабом отталкивании молекул в растворе, а в остальном кривые, зарегистрированные при разных концентрациях, были идеально накладывается. Кривые самой низкой концентрации были сочтены слишком зашумленными и в дальнейшем не учитывались.Таким образом, расчетное значение R г из приближения Гинье было экстраполировано при нулевой концентрации для обоих образцов на основе линейной корреляции четырех других концентраций. Объединенная кривая с использованием кривой низкой концентрации (1,7 мг/мл) в области низких значений q (<0,085 Å -1 ) и кривой высокой концентрации (5,9 мг/мл) была получена для каждого из белков BT4661 с и без лиганда и используют на последующих стадиях.

Форма BT4661 и BT4661L с низким разрешением в растворе была определена ab initio из объединенной кривой рассеяния с использованием программы GASBOR (39).Эта программа восстанавливает формы белков с низким разрешением и вычисляет объем, заполненный плотно упакованными сферами (фиктивные остатки диаметром 3,8 Å), аппроксимируя экспериментальную кривую рассеяния с помощью моделируемой процедуры минимизации отжига с ограничением распределения ближайших соседей и приводя к χ 2 значения 0,99 и 1,00 для BT4661 и BT4661L соответственно. Для сравнения, CRYSOL (40) использовали для расчета соответствия кристаллической структуры (идентификационный код PDB 4AK1) экспериментальной кривой рассеяния, что дало значения χ 2 , равные 2.07 и 4,72 соответственно.

Было проведено несколько независимых подгонок без ограничений по симметрии, а стабильность и согласованность решения были проверены путем вычисления нормированных значений пространственной невязки 1,62 (BT4661) и 1,54 (BT4661L) для пяти независимых расчетов с использованием DAMAVER (41). Полученные оболочки сравнивали с кристаллической структурой путем наложения объектов с помощью PyMOL (версия 1.74; Schrödinger).

BT4657

PL12 + 1 (активный сайт) Специфичность.

Когда смесь двух сильно сульфатированных тетрасахаридов (4 и 5 на рис. S4 B ) обрабатывали BT4657 PL12 , только гликан 4 переваривался с образованием Δ4,5UA-GlcNS6S и Δ4,5UA2S-GlcNS6S (рис. S4 C ). Это открытие предполагает, что сульфатирование 2-O ингибирует BT4657 PL12 , но оставляет неоднозначность, если оно находится в субсайте +1 или -2 [разрывная связь находится между сахарами в -1 и +1, с невосстанавливающим и восстанавливающим концами субстрата, простирающегося на отрицательный и положительный участки соответственно (42)].Обработка смеси тетрасахаридов BT1596, 2-O сульфатазой, которая специфически удаляет 2-O сульфатные группы с невосстанавливающего конца Δ4,5UA, давала тетрасахарид (гликан 6 на рис. S4 B ), который все еще не расщеплялся BT4657 (рис. S4 C ). Эти данные показывают, что BT4657 PL12 не переносит 2-O сульфатирование UA в его субсайте +1, и обеспечивают биохимическую основу для его предпочтения HS и ΔSHep, которые содержат гораздо меньшее количество 2-O сульфатирования, чем Hep (рис.1).

Биохимическая и структурная характеристика сульфатаз.

BT1596 2S-sulf и BT4656 6S-sulf имеют топологию кармана с предполагаемыми участками связывания металла, расположенными в основании кармана. В BT1596 2S-sulf этот сайт включает D40, h51, D299 и h400, тогда как в BT4656 6S-sulf эту роль выполняют боковые цепи D37, D38, D349 и Q350. В обоих белках остатки формилглицина и каталитически лабильный сульфат завершают окта-координированную геометрию связанного металла.Ион кальция можно было смоделировать только в месте BT4656 6S-sulf . Важность сайта связывания металла подтверждается наблюдением, что мутации D37A, D38A и D349A в BT4656 и h400A в BT1596 2S-sulf полностью инактивируют соответствующие ферменты (таблица S6). Ни один из ферментов не может быть инактивирован ЭДТА, что позволяет предположить, что металл либо чрезвычайно прочно связан, либо недоступен для ЭДТА.

В BT1596 2S-sulf сульфатная группа O2 Δ4,5-ненасыщенного UA вступает в потенциальное ионное взаимодействие с Nζ K133 и K312 и водородными связями с Nδ N101 и Nε2 h296, и это может сделать полярным контакт с основной цепью амина каталитического остатка S72.Мутации K133A и N106A вызывали существенное снижение каталитической активности, подтверждая важную роль лизина и аспарагина в связывании сульфата (таблица S6). E394 взаимодействует с O3 ненасыщенного IdoA, а вариант E394A показал 1000-кратное снижение k cat / K m . Y395 взаимодействует с гликозидным кислородом через боковую цепь. Мутация Y395A не повлияла на k cat / K m , но значительно увеличила K m и k cat .Этот результат свидетельствует о том, что остаток способствует связыванию, но не способствует стабилизации переходного состояния, тогда как соразмерное увеличение k cat , вероятно, отражает увеличение скорости выведения продукта (таблица S6). Восстановительный конец GlcNS6S мало взаимодействует с BT1596 2S-sulf , а R245 образует водородную связь с O3 и возможное ионное взаимодействие с сульфатом N2, оба через Nδ2. Существует также потенциальное взаимодействие между сульфатом O6 и Nζ K133.Мутация R245 в Ala имела тот же эффект, что и обсуждавшаяся выше мутация Y395A, демонстрируя важную роль в связывании субстрата. Мутант Y395F был полностью неактивен, что позволяет предположить, что более гидрофобная природа боковой цепи препятствует связыванию субстрата.

В BT4656 6S-sulf обе мутации N98A и K362A инактивируют фермент (таблица S6). N98 находится внизу активного центра и взаимодействует с сульфатом O6 через Nδ2. K362 потенциально связывается водородными связями с тиоэфирной связью сульфата O6, но также взаимодействует с D38 сайта связывания кальция.Мутация K362 потенциально может нарушить сайт связывания металла и, таким образом, привести к потере активности мутанта K362A. K125, по-видимому, играет важную роль в связывании сульфата O6, поскольку замена K125A привела к 1000-кратному снижению активности. Q147 связывается с кислородом эндоциклического кольца и сульфатом O6 через Nε2, а вариант Q147A вызывает примерно 30-кратное снижение активности (таблица S6). Важность взаимодействия между E446 и O1 и N2 субстрата иллюстрируется 1000-кратным снижением активности, опосредованным мутацией E446A.Замена h547A снизила активность в 500 раз, предполагая, что h547 является единственным остатком, осуществляющим продуктивные взаимодействия через O3.

Как для BT1596, так и для BT4656 были предсказаны сигнальные пептиды (www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/), что предполагает периплазматическое расположение этих ферментов, что согласуется с биохимическими данными. Вероятно, сульфамидаза BT4655 является предполагаемым белком ТАТ (www.cbs.dtu.dk/services/TatP/) и, следовательно, также, вероятно, периплазматическим. Обратите внимание, что N-концевой метионин в каждом из этих белков неверен в последовательности базы данных и должен быть на 23 остатка ниже по течению в BT4656 (правильный термин N начинается MKSN), 7 остатков вверх по течению в BT1596 (правильный термин N начинается MKTI) , и 37 остатков вверх по течению в BT4655 (правильный термин N начинается с MDRR).

Обсуждение

Bt PUL Hep организует иерархическую деградацию Hep и HS. Оба этих ГАГ могут быть получены из пищевого мяса или гликанов хозяина. In vivo экспрессия PUL Hep у мышей, колонизированных Bt , наблюдалась только у бактерий, населяющих слой слизистой оболочки, что позволяет предположить, что источником Hep/HS, доступным для Bt , является обмен эпителиальных клеток, а не диета. (27). HS также может поступать в рацион человека в виде компонента мяса; однако метагеномные данные толстой кишки, полученные в исследовании, в котором испытуемых переводили с вегетарианской диеты на диету, богатую мясом, не выявили каких-либо семейств PL, связанных с деградацией Hep/HS (28).Эти данные подтверждают гипотезу о том, что источником Hep/HS в кишечнике человека, доступным для микробиоты, является оборот эпителиальных клеток. Гудман и др. (29) идентифицировали с помощью генов мутагенеза транспозонов в Bt , важных для колонизации кишечника мыши. Штаммы со вставками в bt4659 susD-подобные значительно снижали выход из кишечника моноколонизированных мышей по сравнению с входом. Интересно, что у мышей, колондированных с шестью другими бактериоидами в дополнение к мутантному населению BT , BT4658 GH88 и BT4661 SGBP Muttants вставки были намного ниже в изобилии, чем в монолонированных мышах, указывающих что способность разлагать HS находится под повышенным давлением отбора для Bt в присутствии других Bacteroidetes (рис.С2) .

Внутри ГАГ на основе Hep существует существенное структурное разнообразие, особенно с точки зрения уровня сульфатирования, и именно эта гетерогенность объясняет различную, но дополняющую активность ферментов, кодируемых PUL Hep . Ключевой особенностью аппарата разложения PUL Hep является поверхностная лиаза, BT4662 PL12 , которая, хотя и не нужна для роста на Hep, играет значительную роль в оптимальном использовании HS.Это различие, вероятно, отражает более высокую DP HS по сравнению с Hep, и, таким образом, GAG необходимо подвергнуть определенной степени внеклеточной деполимеризации для образования молекул, которые могут быть импортированы в периплазму (5).

В периплазме субстратная специфичность эндопроцессивных лиаз оптимизирована для нацеливания на высоко сульфатированные (BT4675 PL13 ) или низко/несульфатированные области (BT4657 PL12 ), продуцирующие небольшие олигосахариды, которые продуцирует только экзопроцессивная лиаза (BT4652 54 PL 1154) способен деградировать.Эта роль для BT4652 PL15 является критической, поскольку потеря фермента означает, что элементы как Hep, так и HS остаются недоступными для Bt . Присутствие лиазы PL15 является консервативным признаком использования Hep/HS у других Bacteroidetes, что подтверждает ее ключевую роль в разрушении этих GAG (Fig. S2). Синергическая специфичность, проявляемая лиазами PUL Hep , позволяет бактериям расщеплять основу ГАГ, которые демонстрируют существенные структурные вариации, особенно в их характере сульфатирования, что приводит к образованию дисахаридов.Дисахариды расщепляются дополнительной активностью сульфатаз и фермента GH88, образующего сахара, которые затем могут метаболизироваться бактерией.

Bt уделяет большое внимание утилизации Hep и HS, о чем свидетельствует отсутствие репрессии PUL Hep другими полисахаридами и глюкозой (30). HS является богатым источником GlcNAc, который необходим для синтеза пептидогликана. Хотя Bt , по-видимому, содержит все гены биосинтеза, необходимые для образования GlcNAc, он все же может отдавать предпочтение GlcNAc, полученному из гликанов, для синтеза своей клеточной стенки.Как указано выше, мы предполагаем, что Bt использует HS/Hep из слизистой оболочки хозяина, а не из рациона. Поскольку эпителий, вероятно, содержит гораздо большее количество HS по сравнению с Hep, мы считаем, что биологически значимым гликаном, на который нацелен PUL Hep , является HS. Анализ геномов других членов CM выявил PUL, сходные с Bt PUL Hep (рис. S2). Bacteroides xylanisolvens и Bacteroides ovatus оба содержат предсказанную поверхностную лиазу PL12, аналогичную BT4662 PL12 , что позволяет предположить, что эти организмы также нацелены на HS.Напротив, в аппарате деградации ГАГ Bacteroides enteralis отсутствует явная поверхностная Hep/HS-лиаза (рис. S2). Таким образом, бактерия может нацеливаться на олигосахариды или низкомолекулярные ГАГ, такие как Hep, которые могут быть импортированы без необходимости ферментативной деполимеризации.

Структурные данные сульфатаз показали, что взаимодействия с сульфатом-мишенью высококонсервативны у BT1596 2S-sulf , BT4656 6S-sulf и человеческой 6S GalNAc сульфатазы (GALNSase) (рис.S3 F ). Однако в BT4656 6S-sulf и GALNSase (единственная другая 6-O углеводсульфатаза, для которой доступна структура; идентификационный код банка данных белков 4FDI) очень мало консервативных остатков, которые взаимодействуют с углеводным компонентом белка. субстрата (рис. S3 G ), показывая, что эта область очень вариабельна и может быть основой для высокоспецифичных ингибиторов гликосульфатазы. Такие ингибиторы могут иметь терапевтическое значение, поскольку недавнее исследование показало, что в модели мышей, чувствительных к колиту, сульфатазы, экспрессируемые Bt , являются важными факторами, вызывающими заболевание (31).

Выводы

В этом отчете описывается характеристика PUL, которая управляет деградацией Hep/HS, высокоприоритетных гетерогенных гликанов. В отличие от других микробных систем, которые удаляют боковые цепи до деградации основной цепи, гликановая основная цепь Hep/HS деполимеризуется до удаления сульфатных групп. Для достижения этой деполимеризации Bt экспрессирует лиазы с дополнительными активностями, которые в сочетании могут полностью разрушать ГАГ на основе Hep.PL, сульфатазы и GH, кодируемые PUL Hep , представляют собой пример того, как консорциум ферментов может разлагать субстраты, которые демонстрируют сильно изменчивые модели сульфатирования. Понимание механизмов, с помощью которых кишечные бактерии деполимеризуют ГАГ, может дать ключевое представление о том, как микробиота кишечника человека адаптируется к использованию немюциновых гликанов хозяина, и о роли, которую этот процесс играет в колонизации и выживании в кишечнике. Разработанная здесь модель может быть использована для изучения метагеномных данных для изучения механизмов, с помощью которых различные представители микробиоты метаболизируют эти сложные ГАГ.

Материалы и методы

Bacteroides Культуры и генетические манипуляции.

Bt VPI-5482 культивировали анаэробно, и геномные нулевые мутации были получены, как описано ранее (16, 32).

Ферментные анализы.

Активность PL отслеживалась по телефону A 235 . Активность глюкуронилгидролазы BT4658 GH88 определяли путем мониторинга потери сигнала на A 235 . Сульфатазную и киназную активности определяли либо с помощью связанных анализов, либо с помощью ВЭЖХ.Продукты анализировали с помощью ТСХ и/или ВЭЖХ.

SI Материалы и методы

Источники углеводов.

Углеводы были от Dextra Laboratories, за исключением HS, который был либо от Iduron, либо от J. Turnball (Ливерпульский университет, Ливерпуль, Соединенное Королевство).

Bacteroides Культура и генетические манипуляции.

Bt VPI-5482 культивировали анаэробно на рабочей станции Whitley A35 (Don Whitley) при 37 °C либо в среде с триптоновым дрожжевым экстрактом и глюкозой, либо в минимальной среде (MM), как описано ранее (5, 7). Штаммы Bt , содержащие специфические генные делеции или инактивированные версии ферментов, были получены путем контрселективного аллельного обмена, как описано ранее (32). Δbt4654 ROK , ΔBT4655 NS-SULF NS-SULF , ΔBT4675 PL13 и ΔBT4662 PL12 Детали — все удаленные мутанты, тогда как для штаммов ΔBT4652 PL15 и Δ4657 PL12 , только ключевые остатки активного центра были мутированы в соответствующих ферментах. Рост WT и мутантов измеряли на гликанах путем смешивания стерилизованных в автоклаве полисахаридов (конечный 1%) с ММ и непрерывного мониторинга роста в 96-луночных планшетах с использованием планшет-ридера Biotek Epoch.Представленные кривые роста являются средними из трех биологических повторностей.

Микроскопия.

Выращенные на глюкозе клетки собирали в среднеэкспоненциальной фазе и фиксировали в течение 90 мин в формалине. Первичные антитела инкубировали 1/1000 в течение 2 часов при комнатной температуре (КТ), а вторичные антитела (козий антикроличий FITC из Санта-Крус) в соотношении 1/500 инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Клетки помещали на 1,2% агаровые пластины, иммобилизованные в генной рамке (ABgene), с использованием покровного стекла толщиной от 0,13 до 0,17 мм (VWR). Микроскопию проводили на инвертированном эпифлуоресцентном микроскопе (Zeiss Axiovert 200M) с объективом Plan-Neofluar (Zeiss 100×/1.30 Oil Ph4), ксеноновой дуговой лампе мощностью 300 Вт, проходящей через жидкий световод (Sutter Instruments), и охлаждаемой ПЗС-камере Sony CoolSnap HQ (Roper Scientific). Все фильтры представляли собой модифицированные наборы Magnetron ET от Chroma, подробности доступны по запросу. Цифровые изображения были получены и проанализированы с помощью программного обеспечения METAMORPH (версия V.6.2r6).

Обработка целых клеток протеиназой К.

Культуры Bt (100 мл) выращивали в ММ с Hep в качестве единственного источника углерода до среднеэкспоненциальной фазы (OD 600 ∼ 0.6–0,8; контролируется с помощью измерителя плотности клеток Biochrom WPA). Клетки собирали центрифугированием и промывали в 10 мл PBS перед ресуспендированием в 5 мл буфера. Клетки делили на четыре аликвоты по 1 мл. К трем аликвотам добавляли 2 мг/мл протеиназы К и инкубировали при 37°С в течение 1–16 ч, а четвертый образец оставляли в качестве необработанного контроля также на 16 ч. После инкубации с протеазой образцы центрифугировали при 5000 × g в течение 10 мин и удаляли надосадочную жидкость.Осадок клеток ресуспендировали в 1 мл PBS, белки осаждали добавлением 200 мкл трихлоруксусной кислоты и инкубацией на льду в течение 30 мин. Осажденные белки осаждали центрифугированием и промывали четыре раза в 1 мл охлажденного льдом ацетона. Белковые осадки ресуспендировали в 250 мкл буфера Лэммли и подвергали SDS/PAGE. Гели переносили на нитроцеллюлозную мембрану Whatman Protran BA 85. Интересующие белки выявляли с использованием антисыворотки крыс против BT4661, BT4662 или BT4657.Используемое вторичное антитело представляло собой куриное антикрысиное антитело, конъюгированное с HRP. Детекцию проводили с помощью хемилюминесценции с использованием субстрата Biorad Clarity Western ECL Substrate.

Коиммунопреципитация.

Иммунопреципитацию проводили с использованием набора для коиммунопреципитации Pierce (co-IP) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки из 30 мл WT Bt , выращенные на MM Hep до среднеэкспоненциальной фазы, лизировали с использованием BugBuster (Novagen) и солюбилизированный экстракт предварительно очищали контрольной смолой.Весь лизированный клеточный материал пропускали через колонку с антителом против BT4661 (100 мкл агарозной смолы, приготовленной с 500 мкг антитела и сшитой в соответствии с инструкциями производителя). Колонку инкубировали при осторожном покачивании при 4 °C в течение 16 ч, чтобы вытащить BT4661 и любых взаимодействующих партнеров из лизата. Затем колонку тщательно промывали элюирующим буфером (pH 2,8; содержащий первичные амины) при 4°C, и материал, оставшийся связанным с иммобилизованным антителом, элюировали буфером с низким pH.Элюированные фракции нейтрализовали 1 М Трис, рН 9,5, и анти-ВТ4661 (выращенными у кроликов) или анти-ВТ4659 (выработанными у крыс) антителами, используемыми для зондирования мембран. Обнаружение проводилось с помощью антикроличьего или крысиного HRP-конъюгированного вторичного вещества.

Анализы целых клеток.

Bt выращивали в 5 мл ММ с 1% (вес/объем) соответствующего ГАГ или глюкозы в качестве единственного источника углерода до среднеэкспоненциальной фазы в стеклянных пробирках. Клетки собирали центрифугированием при 5000× g в течение 10 минут при комнатной температуре и промывали в 5 мл PBS (pH 7.1) перед ресуспендированием в 1 мл PBS. Промытые клетки анализировали против 10 мг/мл -1 соответствующего ГАГ при 37°С в течение 72 часов. Анализы анализировали с помощью ТСХ, и 2 мкл каждого образца наносили на пластины с силикагелем и разделяли в буфере бутанол:формиат:вода (4:8:1). Планшеты сушили и визуализировали сахара с помощью окрашивания дифениламином.

Производство рекомбинантного белка.

Гены амплифицировали с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а амплифицированную ДНК клонировали в pET28a с использованием сайтов рестрикции NcoI/XhoI или NheI/XhoI, создавая конструкции с N- или C-концевыми метками His6.Рекомбинантные гены экспрессировали с помощью штаммов Escherichia coli BL21 (DE3) или TUNER (Novagen), содержащих соответствующую рекомбинантную плазмиду, и культивировали до средней экспоненциальной фазы в LB с добавлением 50 мкг/мл канамицина при 37 °C и 180 об/мин. Затем клетки охлаждали до 16 °C и индуцировали экспрессию рекомбинантного гена путем добавления 0,1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида; клетки культивировали еще 16 ч при 16°С и 180 об/мин. Затем клетки центрифугировали при 5000 × g и ресуспендировали в 10 мМ Hepes, pH 7.5, с 500 мМ NaCl перед обработкой ультразвуком на льду. Затем рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов с использованием матрицы на основе кобальта (Talon, Clontech) и элюировали 100 мМ имидазолом. Для структурных исследований белков (BT1596, BT4661 и BT4656) был использован еще один этап эксклюзионной хроматографии с использованием Superdex 16/60 S200 (GE Healthcare) с 10 мМ Hepes, pH 7,5 и 500 мМ NaCl в качестве элюента, и их чистота была оценена как ≥95% с помощью SDS/PAGE.Концентрации белка определяли путем измерения поглощения при 280 нм с использованием молярного коэффициента экстинкции, рассчитанного ProtParam на сервере ExPasy (web.expasy.org/protparam/).

ИТЦ.

Сродство BT4661 SGBP и BT4659 SusD-подобного к олиго- и полисахаридам было количественно определено с помощью ITC с использованием Microcal VP-ITC. В образец белка (50 мкМ), перемешиваемый при 300 об/мин в реакционной ячейке объемом 1,4 мл, вводили 26 аликвот по 10 мкл лиганда. Титрование проводили в 20 мМ Na-Hepes буфере, рН 7.5, при 25°С. Интегрированные теплоты связывания за вычетом контролей теплоты разбавления были приспособлены к модели связывания с одним набором сайтов для получения K a , ∆H и n (количество сайтов связывания на каждой молекуле белка) с использованием Microcal Origin v7.0. . Молярную концентрацию сайтов связывания, присутствующих в полисахаридах для каждого белка, определяли путем изменения концентрации лиганда, используемого для регрессии изотермы, до тех пор, пока подгонка не давала значения, равного единице для n .

Эксперименты SAXS.

Очищенный BT4661 SGBP (как описано выше) концентрировали до ∼6 мг/мл с использованием центриконовых устройств с отсечкой 10 кДа. Для BT4661 в комплексе с Hep (BT4661L) перед концентрированием раствора к белку добавляли 1 мг/мл лиганда. Была приготовлена ​​серия разведений буфером с 10 мМ Hepes, pH 7,5, 250 мМ NaCl и 5% глицерина с лигандом 1 мг/мл и без него для получения пяти образцов, охватывающих диапазон концентраций от 0,8 до 5,9 мг/мл для BT4661 в наличие и отсутствие лиганда.Образцы белка перед каждым измерением фильтровали через фильтр Millex-GV с мембраной PVDF с отсечкой 0,22 мкм.

Эксперименты SAXS проводились на линии луча X33 Европейской лаборатории молекулярной биологии (Deutsches Electronen Synchrotron) с использованием детектора Pilatus 500 K. Раствор БСА с концентрацией 4,2 мг/мл измеряли в качестве эталона и для калибровки. Картины рассеяния измеряли при времени экспозиции 4 х 30 с при 288 К. Длина волны 1,5 Å. Расстояние от образца до детектора было установлено равным 2.4 м, что приводит к векторам рассеяния q (определяемым как q = 4π/λsinθ, где 2θ — угол рассеяния) в диапазоне от 0,06 до 0,5 Å −1 . Кривые SAXS были измерены на образцах белка с различными концентрациями для проверки взаимодействия между частицами. Фоновое рассеяние измеряли после каждого образца белка с использованием буферного раствора, а затем вычитали из картин рассеяния белка после надлежащей нормализации и коррекции отклика детектора. Абсолютную калибровку проводили с образцом люполена.Опыты проводились при температуре 20°С.

Ферментные анализы.

Все анализы, если не указано иное, проводились в 50 мМ MES, pH 6,0, или бис-трис-пропане, pH 6,5, с 150 мM NaCl и 5 мМ CaCl 2 при 37 °C. Активность PL непрерывно контролировали при A 235 по образованию двойной углеродной связи, генерируемой посредством механизма бета-элиминации ферментов. Активность глюкуронилгидролазы BT4658 GH88 определяли путем мониторинга потери сигнала на A 235 .Способность BT1596 удалять сульфатирование O2 из ненасыщенных дисахаридов Hep непрерывно контролировали по потере сигнала на A 235 с помощью связанного анализа с использованием BT4658 GH88 (неактивен в отношении O2-сульфатированных ненасыщенных дисахаридов Hep) для косвенного наблюдения за потерей сульфатации О2. Способность BT4656 6S-sulf удалять сульфатирование O6 из GlcNAc6S контролировали по продукции GlcNAc, обнаруженной с помощью анионообменной хроматографии высокого давления (HPAEC) с импульсным амперометрическим детектированием с использованием стандарта углеводного квадроцикла для электрохимического детектирования на золоторудном предприятии. электрод с pH-электродом сравнения Ag/AgCl и защитной и аналитической колонкой Carbopac PA-100 (Dionex; ThermoFisher).Способность рекомбинантного BT4654 ROK фосфорилировать различные сахара оценивали путем проведения анализов сахаркиназ, как описано ранее (33). Вкратце, АДФ, образующийся в результате переноса фосфата на акцептор сахара, используется пируваткиназой для образования АТФ и пирувата, который используется лактатдегидрогеназой для окисления НАДН до НАД+, и, таким образом, потеря поглощения при 340 нм может быть косвенно использована для следить за фосфорилированием сахаров. Профили реакции PL расщепления ГАГ контролировали с помощью HPAEC с использованием детектора поглощения AD25 при A 235 для обнаружения продуктов двойной углеродной связи с H 2 O, pH 3.5, в качестве элюента и второго элюента H 2 O с 3 М NaCl, используемого для создания линейного градиента NaCl до 50% в течение 80 мин. Для экспериментов по истощению субстрата использовалось уравнение ( k cat / K m )⋅ t = ln(S 0 /S t ) с помощью линейной регрессии. . Чтобы определить все другие кинетические данные, начальную скорость в зависимости от диапазона концентраций субстрата подгоняли к уравнению Михаэлиса-Ментен с помощью нелинейной регрессии с использованием Graphpad Prism 6.0. Все анализы проводились в трех экземплярах, если не указано иное.

Кристаллизация BT1596, BT4661 и BT4656.

После очистки BT4661 подвергали диализу против сверхчистого H 2 O, тогда как BT1596 и BT4656 переносили в тот же элюент, который использовался для эксклюзионной хроматографии. Затем все белки концентрировали в центрифужных концентраторах с порогом молекулярной массы 30 кДа. Скрининг с разреженной матрицей помещали в 96-луночные планшеты TTP Labtech с сидячими каплями (капли объемом 400 нл).Исходные кристаллы BT1596, связанные с лигандом, получали при 5 мг/мл с 10 мМ лиганда в 20% ПЭГ 3350 и KCl. Для BT4656 начальные попадания, связанные с апо- и лигандом, были получены при 20 мг/мл -1 в 2 М NH 4 SO 4 , 0,1 М цитрата натрия, рН 5,6 и 0,2 М сегнетовых солей с 20% ПЭГ. 3350 и NaNO 3 соответственно. Apo BT4661 кристаллизовался в количестве 10 мг/мл -1 в 18-23% ПЭГ 3350, 350 мМ NaSO 4 и 0,1 М бис-триспропана, рН 8,0. Усеченный BT4661 кристаллизовали в количестве 10 мг/мл -1 с 5 мМ гексасахарида Hep в 25% ПЭГ 1500 и 100 мМ ММТ (1:2:2 — DL-яблочная кислота:МЭС:трис-основание), рН 6.Данные были собраны в Diamond Light Source (Оксфорд) на линиях пучка I02 и I04-1 (0,92 Å) при 100 K. Данные были интегрированы с помощью XDS и масштабированы с помощью Aimless. Пять процентов наблюдений были случайным образом отобраны для набора Rfree. Проблема фаз была решена путем молекулярной замены с использованием программы Phaser для BT1596 с идентификационным кодом модели поиска Protein Data Bank (PDB) 3B5Q и автоматизированного сервера молекулярной замены Balbes для BT4656. Кристаллическая структура BT4661 была решена с использованием одноволновой аномальной дисперсии (SAD) на основе селенометиониновых (SeMet) сайтов.Определение структуры используемых программ в CCP4i. Сайты и фазы были определены с использованием конвейера SHELXC/D/E в CCP4i с использованием интенсивности (34). Из-за сходства размеров ячеек между SeMet и нативным кристаллом фазы из эксперимента SAD могут быть перенесены и расширены до нативного набора данных с более высоким разрешением. Качество фазы позволило нам использовать автоматизированное построение модели с помощью ARP/wARP. Модели были завершены с использованием итерационных циклов уточнения с помощью refmac5 и построения модели с использованием COOT.Набор данных, полученный из укороченного BT4661, кристаллизованного в присутствии лиганда, был решен с помощью Molrep с использованием соответствующей модели PDB из нативной формы апо. Молекулы растворителя добавляли с использованием растворителя ARP/wARP и проверяли вручную. Модель прошла циклы построения модели в COOT и уточнения в Refmac5. Все остальные вычисления использовали набор программ CCP4. Модель была проверена с использованием MolProbity, а статистика данных, детали уточнения и идентификационные коды PDB представлены в таблице S2. Представления структуры были сделаны с помощью Pymol (версия 1.74; Шредингер).

Сайт-направленный мутагенез.

Сайт-направленный мутагенез проводили с использованием набора QuikChange на основе ПЦР (Stratagene) в соответствии с инструкциями производителя, используя соответствующую плазмиду в качестве матрицы и соответствующие пары праймеров. Мутанты BT4661 SGBP анализировали на нативных гелях PAGE в присутствии или в отсутствие Hep (конечный 0,1%; добавляли в гель перед полимеризацией) для оценки их способности связывать GAG.

Сравнительный геномный анализ.

PULs, сходных с Bt PUL Hep , были найдены в >300 геномах Bacteroidetes. Идентификация похожих PUL была основана на сочетании модульного выравнивания PUL и поиска BlastP. Состав и порядок генов во всех PUL Bacteroidetes были сначала рассчитаны с использованием предиктора PUL, описанного в PULDB (35). Затем предсказанные PUL были сопоставлены с PUL Hep в соответствии с их модульностью, как это было предложено в методе RADS/RAMPAGE для выравнивания белков на уровне домена (36).Принимаемые во внимание модули включают семейства CAZy, сенсорные регуляторы, сульфатазы и гены, подобные susCD. Наконец, границы PUL и предельные случаи были уточнены с помощью анализа на основе BLASTP на уровне белка.

Благодарности

Мы благодарим Карла Морланда за квалифицированную техническую помощь. Эта работа финансировалась Исследовательским советом по биотехнологии и биологическим наукам Соединенного Королевства (грант BB/F014163/1), Европейским исследовательским советом (грант 322820) и Wellcome Trust (грант WT097907MA).

Сноски

  • Вклад авторов: A.C., E.C.L., H.J.G. и D.N.B. проектное исследование; A.C., E.C.L., A.B., S.J.F., D.A.N., H.M., N.T., V.L. и M.C. проведенное исследование; ДЖЕТ предоставил новые реагенты/аналитические инструменты; A.C., E.C.L., A.B., S.J.F., H.M., N.T., V.L., B.H., M.C. и D.N.B. проанализированные данные; и A.C., E.C.L., B.H., J.E.T., M.C., H.J.G. и D.N.B. написал бумагу.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  • Эта статья является прямой отправкой PNAS.

  • Депонирование данных: Кристаллография, координаты атомов и структурные факторы были депонированы в Protein Data Bank, www.pdb.org (идентификационные коды PDB 4AK1, 4AK2, 5G2T, 5G2U и 5G2V).

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1704367114/-/DCSupplemental.

Бесплатно доступны в Интернете через опцию открытого доступа PNAS.

Простой метод измерения сульфирования у человека с использованием парацетамола в качестве пробного препарата

В этой популяции здоровых взрослых PSI показал низкую индивидуальную вариабельность с хорошей корреляцией между значениями в образцах плазмы и мочи.PSI мочи не зависел от факторов, не связанных с активностью ферментов, таких как pH мочи или рСКФ. Пол и прием оральных контрацептивов не влияли на наш метаболический коэффициент.

До сих пор исследования вариабельности активности SULT проводились на животных или in vitro 2 с использованием ферментативной активности или исследований экспрессии в клеточных цитозольных фракциях 14 . Несколько существующих клинических исследований, оценивающих способность к сульфированию, были сосредоточены на различиях в метаболизме серы при различных болезненных состояниях, а не на разработке проверенного метода измерения активности SULT 17,18,19,20,21,22 .

По сравнению с этими предыдущими исследованиями активности SULT, основным новшеством нашей работы является намерение измерить сульфоконъюгацию в клиническом контексте. Для этого мы выбрали метод метаболического фенотипирования. Метаболическое профилирование в настоящее время является общепринятым интегративным подходом к стратификации пациентов в соответствии с активностью ферментов, метаболизирующих лекарственные препараты, чувствительных как к генетическим, так и к факторам окружающей среды, и широко используется для изучения цитохромов 42 . То же самое не относится к ферментам фазы 2, где N-acetyltransferase type 2 является единственной с установленным зондовым субстратом 43 .

Парацетамол в качестве пробы для изучения сульфирования

Другие до нас использовали парацетамол для изучения сульфирования, но с другими целями. В основополагающей работе по SULT 80-х годов Reiter et al. изучили ферментативную активность SULT в цитозолях тромбоцитов и ее корреляцию с сульфатной конъюгацией парацетамола in vivo, сделав вывод, что изменения активности SULT тромбоцитов отражают индивидуальные различия в экскреции с мочой сульфатного конъюгата парацетамола 44 .В том же десятилетии Bonham-Carter использовал аналогичный дизайн для проверки корреляции между активностью SULT, измеренной с различными субстратами, и конъюгацией парацетамола и салициламида in vivo у человека, но пришел к другому выводу: они не обнаружили существенной связи между активностью SULT. vivo образец сульфоконъюгации любого препарата и активность SULT тромбоцитов, проанализированная с тирамином 45 . На протяжении 90-х Waring et al. подготовил обширную литературу, посвященную изучению изменений ксенобиохимии серы при беременности, циркадных ритмах и некоторых хронических заболеваниях, включая аутизм, мигрень, воспалительный артрит, билиарный цирроз и хронические неврологические заболевания 17,18,19,20,21,22,46,47 .Эта команда использовала сульфат парацетамола и отношение PS/PG в качестве оценки способности к сульфатированию, что привело к таким прорывам, как научные доказательства, свидетельствующие об аномальном метаболизме серы у людей с расстройствами аутистического спектра. Тем не менее, никаких намерений по проверке метода не было. В статье 2009 г. Clayton et al., намереваясь исследовать прогнозирование ответа на лекарство на основе профиля метаболитов в моче перед введением дозы, выбрали парацетамол в качестве примера этого фармакометабономического подхода; при этом они обнаружили важные взаимодействия между сульфированием ксенобиотиков и метаболитами микробиома хозяина 48 .В 2019 году Кук и соавторы, чтобы продемонстрировать, что изоферменты SULT можно избирательно ингибировать в терапевтических целях, вводили взрослому здоровому мужчине как парацетамол, так и мефенамовую кислоту (известный ингибитор SULT1A1) и обнаружили, что сульфирование парацетамола существенно снизилось 49 .

Наш выбор парацетамола в качестве пробного препарата оказался очень удобным, поскольку он отвечает всем необходимым требованиям для такого соединения 43 : широко доступный, безопасный и недорогой терапевтический препарат; с быстрой абсорбцией при пероральном приеме и коротким периодом полувыведения; и, наконец, со значительным метаболизмом с помощью СУЛТ в терапевтических дозах и простой метаболической схемой.С другой стороны, парацетамол метаболизируется не только с помощью SULT; тем не менее, он подвергается прямому сульфированию без промежуточного соединения фазы I и обладает достаточной степенью селективности по отношению к SULT1A1 и SULT1A3. Кроме того, поскольку парацетамол глюкуронируется и сульфируется в терапевтических дозах, а окислительный метаболизм вносит незначительный вклад, он является полезным модельным соединением для изучения конъюгации фазы II 50 . До сих пор клинические исследования метаболических фенотипов были больше сосредоточены на ферментах CYP450, и необходимы доказательства для ферментов фазы II.

Основными изоформами, участвующими в метаболизме парацетамола у взрослых, являются SULT1A1 и SULT1A3 10 . Тем не менее, из предыдущих исследований мы знаем, что на выработку парацетамола сульфата не оказывает существенного влияния способ введения (пероральный или внутривенный), что подразумевает незначительное сульфирование в желудочно-кишечном тракте, что подтверждает основную роль основной печеночной изоформы. SULT1A1, а не основная кишечная изоформа SULT1A3, в метаболизме парацетамола in vivo 51 .При использовании парацетамола в качестве зондового субстрата мы можем предположить, что мы оцениваем ферменты SULT, участвующие в метаболизме перорально вводимых фенольных препаратов, преимущественно активность SULT1A1, основной изоформы SULT в метаболизме лекарств.

PSI как метрика для изучения сульфирования

Путем введения фиксированной дозы парацетамола испытуемым мы могли измерить концентрацию препарата и его метаболитов и построить формулу для вывода об активности фенола SULT: индекс сульфирования парацетамола ( ПСИ).Эта метрика предлагает несколько желательных качеств. Во-первых, метрика кажется достаточно чувствительной, чтобы различать субъектов с более высокой и более низкой способностью сульфирования фенола, как мы можем наблюдать на гистограмме частот.

Во-вторых, PSI как в плазме, так и в моче показал низкий внутрииндивидуальный коэффициент вариации, что свидетельствует о высокой индивидуальной стабильности активности SULT и хорошей воспроизводимости нашего соотношения. Это чрезвычайно важно для метрики фенотипирования 52 .

В-третьих, наша метрика показала хорошую корреляцию между значениями в плазме и моче.Таким образом, для дальнейших исследований мы можем использовать метаболический коэффициент в пробах мочи из-за неинвазивности и простоты отбора проб.

Наконец, PSI мочи не зависит от факторов, не связанных с активностью ферментов, таких как рН мочи и функция почек; это согласуется с сообщениями о почечном клиренсе парацетамола и высокополярных конъюгатов глюкуронида и сульфата, которые быстро выводятся почками без реабсорбции и относительно нечувствительны к изменениям потока мочи, рН мочи и функции почек 32 .

Точность, с которой наша метрика исследуемого препарата, PSI, действительно отражает активность фенола SULT, трудно тщательно проверить, поскольку нет других проверенных показателей для активности SULT in vivo и существует плохая корреляция между активностью in vitro и in vivo 45 . К счастью, доказательства, собранные Куком и соавторами в 2019 году путем совместного введения парацетамола и мефенамовой кислоты взрослому мужчине, косвенно подтверждают нашу метрику: они доказали, что известный ингибитор SULT1A1 снижает выработку сульфата парацетамола, поэтому мы можем сделать вывод, что PSI является чувствительны к ферментативному ингибированию.

Было невозможно связать нашу метрику с генетическими полиморфизмами, поскольку они распределены по этническому признаку и не ожидаются в этнически однородном населении, таком как наше. Кроме того, генетическая изменчивость объясняет только незначительную часть межиндивидуальной изменчивости активности SULT 15 .

Таким образом, в качестве общего предостережения, PSI может отражать ряд переменных фармакокинетических процессов, влияющих на сульфирование фенола, таких как доступность кофактора или изменение альтернативных метаболических путей, таких как конъюгация глюкуронида.Это не даст нам механистической информации, но предоставит нам эмпирическую меру индивидуального статуса сульфоната для фенольных соединений, на что ранее намекало клиническое исследование RH Waring.

Первое понимание индивидуальной изменчивости PSI

Различий в сульфировании между мужчинами и женщинами не обнаружено. Это резко контрастирует с задокументированным половым диморфизмом экспрессии SULT у грызунов 53 и согласуется с предыдущими исследованиями на людях, которые не обнаружили связанных с полом различий в экспрессии различных изоформ SULT в печени 54 и в ферментативных ферментах SULT1A1. активность в цитозолях печени 55 .Это предполагает, что нет необходимости проводить стратификацию по полу для фармакокинетических исследований препаратов, являющихся субстратами SULT1A1. Также не было различий в PSI между женщинами, принимающими и не принимающими оральные контрацептивы, что позволяет предположить: (1) отсутствие влияния гормональных колебаний менструального цикла на сульфирование, (2) отсутствие значимого ингибирования сульфирования разовой терапевтической дозы парацетамола оральными контрацептивами, в отличие от предыдущих результатов in vitro и in vivo 47,56 . Очевидно, что эти данные должны быть подтверждены на большей выборке населения.

В заключение, фенотипирование SULT с использованием парацетамола в качестве зонда может предоставить полезный инструмент для реализации инициатив в области точной медицины для фенольных препаратов, которые в основном метаболизируются SULT. Насколько нам известно, наше исследование представляет собой первую попытку стандартизировать метод фенотипирования, который обеспечивает эмпирическую оценку статуса сульфонатора in vivo у человека. Это простой неинвазивный метод, требующий взятия проб мочи, с использованием безопасного и удобного парацетамола в качестве пробного препарата и с низким внутрииндивидуальным коэффициентом вариации.

Чтобы получить дополнительные знания о PSI, мы в настоящее время изучаем популяцию пациентов с хроническими заболеваниями, с различными сопутствующими заболеваниями и воздействиями окружающей среды и принимающих различные лекарства. Мы ожидаем, что анализ межиндивидуальных вариаций в этой популяции позволит по-новому взглянуть на нашу метрику, поскольку, среди прочего, мы регистрируем вариации PSI для пациентов, получавших известные ингибиторы/индукторы фермента, или в отношении печени и других состояний болезни.

(PDF) Сульфомуцины в организме человека

14 A.В. НьювАмеронгенета/.

Хеммерих С., Бертоцци С.Р., Леффлер Х. и Розен С.Д.

(1994b). Идентификация сульфатированных моносахаридов

GIyCAM-‘1, эндотелиального лиганда для L-селектина. Bio-

chemistry 33, 4820 — 4829.

Хеммерих С., Леффлер Х. и Розен С.Д. (1995). Структура

O-гликанов в GIyCAM-1, лиганде эндотелиального происхождения для

L-селектина. Дж. Биол. хим. 270,12035-12047.

Хо, С.Б., Шекелс, Л.Л., Торибара, Н.В., Ким, Ю.С., Лифтогт, К.,

Червитц, Д.Л., и Ниханс, Г.А. (1995). Экспрессия гена муцина*

в нормальном, предопухолевом и неопластическом эпителии желудка человека

. Рак Рез. 55, 2681 -2690.

Хоффман, М.П., ​​и Хайдарис, К.Г. (1993). Анализ адгезии Candida

albicans к муцину слюны. заразить Иммун. 67,

1940-1949.

Хупер, Л.В., Беранек, М.К., Манцелла, С.М., и Бензигер, Дж.У.

(1 995а). Дифференциальная экспрессия GalNAc-4-сульфотрансферазы

и GalNAc-трансферазы в различных формах карбоангидразы VI в околоушной и подчелюстной железах. Дж. Биол. Хим.270,

5985-5993.

Хупер, Л.В., Хиндсгал, О., и Бензигер, Дж.У. (1995б). Очистка катиона и характеристика GalNAc-4-сульфотрансферазы

, ответственной за сульфатирование GalNAc((1-4)GlcNAc-содержащих

олигосахаридов.Дж. Биол. хим. 270, 1 6327 — 1 6332.

Hovenberg, H.W., Davies, J.R., Herrmann, A., Linden, C.-J., and

Carlstedt, l. (1996а). MUCSAC, но не MUC2, является важным муцином в респираторных выделениях. Гликоконъюгат J. 1 3, 839-847.

Ховенберг, Х.В., Дэвис, Дж.Р., и Карлстедт, л. (1996b). Различные

муцины продуцируются поверхностным эпителием и подслизистой оболочкой

слизистой оболочки трахеи человека: идентификация MUCSAC как

ma.ior муцин из бокаловидных клеток. Биохим. Дж. 318, 319-324.

Лмай Ю. и Розен С.Д. (1993). Прямая демонстрация гетерогенных, сульфатированных O-связанных углеводных цепей на эндотелиальном лиганде L-селектина. Glycoconjugate J. 10, 34–39.

lmai, Y., Lasky, L.A., and Rosen, S.D. (1993). Требование сульфатации для GlyCAM-1, эндотелиального лиганда для L-селектина. Природа

367,555*557.

Инатоми Т., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A.S., Zhan, Q., Feldman,

ST, и Gipson, LK. (1996). Экспрессия генов секреторного муцина

конъюнктивными эпителиями человека. инвест. Офтальм. Вис.

Sci.37, 1684-1692.

Иримура Т., Винн Д.М., Хагер Л.Г., Клири К.Р. и Ота Д.М.

(1 991). Сульфомуцин толстой кишки человека, идентифицированный специфическим ноклональным антителом mo-

. Рак Рез. 51, 5728-5735.

Джасс, Дж. Р., и Робертон, А.М. (1994). Химия колоректального муцина

в норме и при патологии: критический обзор Pathol. инт.

44 487 -504.

Джентофт, Н. (1990). Почему белки гликозилированы? Тренды

Биохим. науч. 75 291 -294.

Джонс, П. К., Коэн, Р. Э., и Левин, М. Дж. (1987). Стрептококковая

агглютинация поднижнечелюстно-подъязычной слюной человека

обедненная муциновыми гликопротеинами. Дж. Дент. Рез. 66, 285, абстр.

1431.

Карлссон, К.-А. (1995). Распознавание микробами конъюгатов глико-

клеток-мишеней. Курс. мнение Структура биол.5, 622-635.

Карлссон Н.Г., Карлссон Х. и Ханссон Г.К. (1996).

Сульфатированные олигосахариды муцина из тонкого кишечника свиньи, проанализированные с помощью четырехсекторной тандемной масс-спектрометрии. J.

Масс-спектр. 31, 560 — 572.

Китс, 4.К., Нуньес, Д.П., Афдал, Н.Х., Трокслер, Р.Ф., и Оффнер,

Г.Д. (1997). Молекулярное клонирование крупного

муцина желчного пузыря человека – полная С-концевая последовательность и геномная организация MUCSB. Биохим. Дж. 324, 295-303.

Кент, П.В., и Марсден, Дж.К. (1963). Сульфатированный сиалопротеин

из муцина толстой кишки овцы. Биохим. Дж. 87, стр. 38.

Кляйн, А., Карной, К., Верушески, Дж. М., Стрекер, Г., Странг,

4.М., ван Хальбик, Х., Руссель, П., и Ламблин, Г. (1992).

Широкое разнообразие нейтральных и сиалилированных олигосахаридов, полученных из слюнных муцинов человека.Biochemistry 37, 6152-

61 65.

Klein, A., Carnoy, C., Lamblin, G., Roussel, P., van Kuik, J.4., и

, Vliegenthart, J.F. (1993). Выделение и структурная характеристика новых сиалилированных олигосахарид-альдитов из респираторно-

гликопротеинов слизи пациента, страдающего брон-

хоэктазами. Евро. J. Bioch em. 211, 491-500.

Klomp, L.WJ., Van Rens, L., and Strous, G.J. (1994). Идентификация предшественника желудочного муцина человека: N-связанное гликозилирование и олигомеризация Biochem.Дж. 304,693-698.

Ниббс Р. Н., Крейг Р. А., Нацука С., Чанг А., Кэмерон М.,

Лоу Дж. 8. и Стулман Л. М. (1996). Фукозилтрансфераза

FuclVII регулирует синтез лиганда Е-селектина в Т-клетках человека.

J. Cell Biol. 133,91 ‘1 — 920,

Kuhns, W., Jain, RK, Matta, KL, Paulsen, H., Baker, M.4.,

Geyer, R., and Brockhausen, I. (1995) . Характеристика активности нового муцинсульфотрансферазы

, синтезирующего сульфатированный

О-гликановый кор’1,3-сульфат-Gal((1-3)GalNAc)-R.Гликобио-

логия 5, 689-697.

Lamblin, G., Aubert, J.P., Perini, J.M., Klein, A., Porchet, N.,

Degand, P., and Roussel, P. (1992). Респираторные муцины человека.

Евро. Отв. Дж. 5,247-256.

Lamblin, G., Lhermitte, M., Klein, A., Houdret, N., Scharfman, A.,

Ramphal, R. and Roussel, P. (1991a). Углеводное разнообразие

респираторных муцинов человека — Защита нижележащей

слизистой оболочки.Являюсь. Преподобный Респ. Дис.144, С19 -524.

Lamblin, G., Rahmoune, H., Wieruszeski, J.M., Lhermitte, M.,

Strecker, G., and Roussel, P. (1991b). Структура двух сульфатированных

олигосахаридов из респираторных муцинов больного

муковисцидозом. Бомбардировка быстрым атомом м.с. и

1 Н-я.м.р. спектроскопическое исследование. Биохим. J.275,199-206.

Ласки, Л.А. (1995). Селектин-углеводные взаимодействия и инициация воспалительной реакции.Анну. Rev. Biochem .64,

‘1 ‘1 3 -‘1 39.

Ласки, Л.А., Сингер, М.С., Довбенко, Д., Имай, Ю., Хензел, Э.Дж.,

Фенни, К., Жиллет , Н., Уотсон, С.Р., и Розен, С.Д. (1992). Эндотелиальный лиганд

для L-селектина представляет собой новую муциноподобную молекулу.

Сотовый 69, 927-938.

Ли, С.П., и Николлс, Дж.Ф. (1 9BO). Природа и состав

билиарного сладжа. Гастроэнтерология 90, 677 — 686.

Левин, М.J., Herzberg, M.C., Levine, M.S., E|lison, S.A., Stinson,

M.W., Li, H.C., and van Dyke, T. (1978). Специфичность взаимодействий слюны с

бактериями: роль концевых остатков сиаловой кислоты во взаимодействии

слюнных гликопротеинов со Streptococcus san-

guis и Sfreptococcus mutans. заразить иммун . 19,1A7 — 1 -l 5.

Левин М.Дж., Редди М.С., Табак Л.4., Лумис Р.Е., Берджи Э.Дж.,

Джонс П.С., Коэн Р.Э., Стинсон, М.В., и Аль-Хашими, л.

(1987). Структурные аспекты слюнных гликопротеинов. Дж. Дент.

Рез. 66,436-441.

Леви, П.Ф., Смит, Б.Е., и Ламонт, Т.Дж.Т. (1984). Муцин желчного пузыря человека

ускоряет образование ядер холестерина в искусственной желчи.

Gastroenterology 87, 27 O — 27 5.

Ley, K., Linnemann, G., Meinen, M., Stoolman, L.M., and Gaeht-

gens, P. (1993). Фукоидин, но не полифосфоманнан дрожжей

PPME, ингибирует свертывание лейкоцитов в венулах брыжейки крысы.(1996). Посттрансляционные модификации ре-

комбинированного гликопротеинового лиганда-1 P-селектина, необходимые для связывания с P- и E-селектином. Дж. Биол. Хим.271, 3255-3264.

Лихтенбергер, Л. М. (1995). Гидрофобные барьерные свойства

желудочно-кишечной слизи. Анну. Преподобный Физиол. 57 565 — 583.

Ligtenberg, A.J.M., Veerman, E.C.l., De Graaff, J., and Nieuw

Amerongen, A.V. (1990а). Влияние группы крови реактивный

Цитозольная сульфотрансфераза человека SULT1A3 Опосредует сульфатирование декстрорфана

Резюме

Декстрорфан, активный метаболит противокашлевого декстрометорфана, подвергается сульфатированию несколькими цитозольными сульфотрансферазами рыбок данио. Мы были заинтересованы в том, чтобы выяснить, какие из СУЛТ человека способны катализировать сульфатирование декстрорфана, и проверить, может ли сульфатирование декстрорфана происходить в культивируемых клетках человека и цитозолях органов человека.Данные ферментативного анализа показали, что из всех тринадцати известных человеческих SULT SULT1A3 проявляет самую сильную декстрорфан-сульфатирующую активность. Эксперименты с культурами клеток с использованием клеток гепатомы человека HepG2 и клеток карциномы толстой кишки человека Caco-2, инкубированных с [ 35 S]сульфатом вместе с различными концентрациями декстрорфана, действительно выявили продукцию и высвобождение [ 35 S]сульфатированного декстрорфана в концентрации зависимый способ. Кроме того, значительная декстрорфан-сульфатирующая активность была обнаружена в цитозолях печени, тонкого кишечника и легких человека.В совокупности эти результаты обеспечили биохимическую основу для сульфатирования декстрорфана у людей.

Декстрометорфан является противокашлевым средством, обычно используемым для лечения кашля, связанного с инфекциями верхних дыхательных путей, такими как простуда и грипп. 1) При пероральном приеме декстрометорфан абсорбируется из желудочно-кишечного тракта, достигая максимальной концентрации в кровотоке примерно через 2,5 часа. 2) В печени декстрометорфан подвергается O -деметилированию под действием цитохрома P450 2D6 (CYP2D6) с образованием декстрорфана. 3,4) Декстрорфан действует как антагонист возбуждающего нейротрансмиттера N -метил-D-аспартата (NMDA), 5) , будучи более мощным, чем декстрометорфан. 6,7) Таким образом, было высказано предположение, что действие декстрометорфана может быть обусловлено превращением в декстрорфан. 8) Интересен вопрос, подвергается ли декстрорфан дальнейшему метаболизму в организме.

Конъюгация сульфатов играет решающую роль в биотрансформации многих ксенобиотиков, в том числе лекарств, у позвоночных. 9–11) В реакциях конъюгации сульфата ферменты цитозольной сульфотрансферазы (SULT) опосредуют перенос сульфонатной группы от донорного соединения, 3′-фосфоаденозин-5′-фосфосульфата (PAPS), на амино- или гидроксильную группу субстрата соединения. 12) Конъюгация сульфатов обычно приводит к инактивации соединений-субстратов и одновременному увеличению их растворимости в воде, тем самым облегчая их выведение из организма. 13) У человека тринадцать различных SULT были идентифицированы и классифицированы в четыре семейства SULT: SULT1, SULT2, SULT4 и SULT6. 14,15) В более раннем исследовании было обнаружено, что несколько SULT рыбок данио способны сульфатировать декстрорфан. 16) Однако остается неизвестным, может ли декстрорфан сульфатироваться каким-либо из человеческих SULT.

В этом исследовании мы исследовали все известные СУЛТ человека на потенциальную сульфатирующую активность по отношению к декстрорфану. Кроме того, было исследовано возможное сульфатирование декстрорфана в культивируемых клетках человека и в образцах органов человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Тартрат декстрорфана и тартрат леворфанола были получены от Cerilliant Corporation (Round Rock, TX, U.С.А.). Дофамин, p -нитрофенол, аденозин 5′-трифосфат, дитиотреитол, N -2-гидроксилпиперазин- N ‘ -2-этансульфоновая кислота (HEPES), минимальная эссенциальная среда (MEM) и эмбриональная телячья сыворотка (FBS ) были продукцией Sigma Chemical Company (Сент-Луис, Миссури, США). Патроны Sep-Pak C18 были продукцией Waters Corporation (США). Сульфат натрия [ 35 S] был приобретен у American Radiolabeled Chemicals (Сент-Луис, Миссури, США). Рекомбинантные SULT человека экспрессировали с использованием клеток-хозяев Escherichia coli BL21 и выделяли, как описано ранее. 17–21) PAP [ 35 S] был ферментативно синтезирован из аденозин-5′-трифосфата и не содержащего носителя [ 35 S]сульфата с использованием аденозин-5′-трифосфатсульфурилазы/аденозин-5′-фосфосульфаткиназы человека. 22) Линия эпителиальных клеток кишечника человека Caco-2 (ATC C HTB-37) и линия клеток гепатомы человека HepG2 (ATC C HB-8065) ​​были получены из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США). Цитозоли кишечника, почек, печени и легких человека были получены от XenoTech, LLC (Lenexa, KS, U.С.А.). Целлюлозные пластины для ТСХ были продуктами EMD Millipore Corporation (Биллерика, Массачусетс, США). Сцинтилляционный коктейль Ecolume был получен от MP Biomedicals, LLC (Ирвин, Калифорния, США).

Ферментный анализ

Декстрорфан-сульфатирующую активность рекомбинантных SULT человека определяли ферментативным анализом с использованием радиоактивного PAP[ 35 S] в качестве донора сульфата. Типичная смесь для анализа с конечным объемом 20 мкл содержала 14 мкМ PAP[ 35 S], 1 мМ дитиотреитола, 50 мМ буфера HEPES (pH 7.0) и 50 мкМ декстрорфана. Анализ начинали добавлением тестируемого фермента SULT, выдерживали в течение 5 минут при 37°C и останавливали, нагревая пробирку, содержащую аналитическую смесь, на сухом блочном нагревателе при 100°C в течение 3 минут. Осадки, образовавшиеся во время тепловой инактивации, удаляли центрифугированием в течение 3 мин при 13000×g, а осветленный супернатант использовали для ТСХ-анализа [ 35 S]сульфатированного декстрорфана. Используемая система растворителей представляла собой н -бутанол-изопропанол-88% муравьиная кислота-вода (2 : 1 : 1 : 2, об./об.).По окончании ТСХ пластину сушили в вытяжном шкафу с последующей авторадиографией с использованием рентгеновской пленки. Радиоактивное пятно, соответствующее [ 35 S]сульфатированному декстрорфану, было расположено на пластине для ТСХ, вырезано и элюировано водой (0,5 мл) в 5-мл стеклянном флаконе. Затем добавляли 4,5 мл сцинтилляционного коктейля Ecolume, тщательно перемешивали и количественно определяли радиоактивность [ 35 S] с помощью жидкостной сцинтилляции. В эксперименте, зависящем от концентрации, проводили ферментативные анализы с использованием различных концентраций декстрорфана в качестве субстратов.Условия реакции и методика анализа [ 35 S]сульфатированного декстрорфана были такими же, как описано выше. Для анализа декстрорфан-сульфатирующей активности цитозолей органов человека аналитическая смесь была обогащена 50 мМ NaF (ингибитор фосфатазы). Реакцию инициировали добавлением тестируемого цитозоля человека и продолжали в течение 30 минут, после чего проводили анализ ТСХ на [ 35 S]сульфатированный декстрорфан, как описано выше.

Масс-спектрометрический анализ

Для приготовления сульфатированного декстрорфана для структурного анализа с помощью масс-спектрометрии было проведено ферментативное сульфатирование декстрорфана с помощью SULT1A3 с использованием нерадиоактивного PAPS в качестве донора сульфата на основе вышеупомянутой процедуры.Конечную реакционную смесь наносили на картридж Waters Sep-Pak C18. Связанный сульфат декстрорфана элюировали смесью вода-метанол (2 : 3, об/об) и элюат сушили с помощью концентратора SpeedVac. Сухой остаток восстанавливали с использованием метанола и анализировали с использованием системы ВЭЖХ Shimadzu Nexera XR и тройного квадрупольного масс-спектрометра LCMS-8050 с режимом отрицательных ионов. Десять микролитров образца вводили с подвижной фазой, состоящей из воды-метанола (1 : 1, об./об.) плюс 0,1% муравьиной кислоты при скорости потока 0.4 мл/мин в капилляр без разделительной колонки. Используемые условия масс-спектрометрии были следующими: поток распыляемого газа, 2,0 л/мин; Расход осушительного газа, 10,0 л/мин; Расход нагревающего газа, 10,0 л/мин; Напряжение интерфейса ESI, 3,0 кВ; Температура интерфейса, 300°С; Температура ДЛ, 250°С; IG Вакуум, 0,02 Па; PG Вакуум, 92 Па; и газ CID, 270 кПа. Исследование метаболического мечения

с использованием культивируемых клеток человека Клетки

Caco-2 и клетки HepG2 обычно культивировали в MEM плюс 10% FBS, пенициллин G (30 мкг/мл) и сульфат стрептомицина (50 мкг/мл).Конфлюэнтные клетки, выращенные в отдельных лунках 24-луночного культурального планшета, сначала предварительно инкубировали в бессульфатной МЕМ с 10% диализированной FBS в течение 4 часов, а затем инкубировали в аликвотах по 0,25 мл той же среды, содержащей 0,3 мКи/мл [, 35]. S]сульфат плюс различные концентрации (0, 5, 10, 25, 50, 100  мкМ) декстрорфана. После 18-часового мечения среды собирали, центрифугировали и анализировали на наличие [ 35 S]сульфатированного декстрорфана на основе вышеупомянутой процедуры ТСХ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Предыдущие исследования с использованием SULT рыбок данио показали, что декстрорфан может метаболизироваться посредством сульфатирования. 16) Это исследование было направлено на изучение того, способны ли и какие из SULT человека (-ов) катализировать сульфатирование декстрорфана. Кроме того, оценивали возможное сульфатирование декстрорфана в культивируемых клетках человека и в цитозолях органов человека.

Идентификация SULT человека, способного сульфатировать декстрорфан

Панель из тринадцати SULT человека была проанализирована на сульфатирующую активность с декстрорфаном в качестве субстрата. Полученные результаты показали, что девять (SULT1A2, SULT1B1, SULT1C2, SULT1C3, SULT1E1, SULT2B1a, SULT2B1b, SULT4A1, SULT6B1) из тринадцати человеческих SULT не обнаруживали активности.Из других четырех SULT (SULT1A1, SULT1A3, SULT1C4, SULT2A1) SULT1A3 проявлял гораздо более сильную активность, чем другие три, по отношению к декстрорфану (таблица 1). Основываясь на этих результатах, SULT1A3, вероятно, является основным ферментом, ответственным за сульфатирование декстрорфана в организме человека. Поскольку для SULT может иметь место ингибирование субстратом и/или продуктом, 9,23) был проведен зависимый от концентрации эксперимент с использованием различных концентраций декстрорфана в качестве субстрата для всех четырех декстрорфан-сульфатирующих SULT.Как показано на рис. 1, в испытанных диапазонах концентраций декстрорфана не наблюдалось значительного ингибирования субстрата или продукта (до 1 мМ для SULT1A3 и SULT2A1 и до 2 мМ для SULT1A1 и SULT1C4). Как показано в таблице 1, помимо декстрорфана, SULT1A3 также был способен опосредовать сульфатирование дофамина (физиологический субстрат), p -нитрофенола (прототип субстрата для фенолсульфотрансфераз) и леворфанола (левовращающий энантиомер декстрорфана). . Интересно отметить, что сульфатирующая активность SULT1A3 с декстрорфаном была более чем в 38 раз выше, чем с леворфанолом, тогда как другие три SULT не проявляли подобной стереоселективности в отношении декстрорфана и леворфанола.Сульфатированный продукт декстрорфана, полученный с помощью SULT1A3, очищали путем твердофазной экстракции с использованием картриджа с обращенной фазой Sep-Pak C18 и далее анализировали с помощью масс-спектрометрии. Как показано на фиг. 2А, был обнаружен заметный ион с m / z из 336, что эквивалентно депротонированному моносульфатированному иону декстрорфана. Этот заметный ион произвел сульфонат-ион с m / z из 80 и десульфированный ион с m / z из 256, который является ионом декстрорфана (рис.2Б). Эти результаты ясно показали, что сульфатирование, опосредованное SULT1A3, происходило по 3-гидроксильной группе ароматической кольцевой структуры декстрорфана. Предыдущие исследования продемонстрировали экспрессию SULT1A3 в некоторых органах человека, включая мозг, желудочно-кишечный тракт, почки, печень и легкие. 24,25) Возможно, что в этих органах SULT1A3 может служить для сульфата декстрорфана, продукта, образующегося после O -деметилирования декстрометорфана с помощью CYP2D6. 3,4)

Таблица 1. Конкретные мероприятия человеческих культур с декстрорфаном в качестве подложки A )

+ + ND + + 91 684
Удельная активность (NMOL / Min / Mg)
Sult1a1 Sult1a3 SULT1C4 SULT2A1
Декстрорфан 0,01 ± 0,01 1,94 ± 0,08 0,02 ± 0,01 0,08 ± 0,01
Levorphanol Н.Д. 0.05 ± 0,01 0,01 ± 0,01 0,03 ± 0,01
Допамин 3,24 ± 0,15 78,11 ± 2,22 0,43 ± 0,02
+ р -Nitrophenol 34,52 ± 1,27 2,93±0,16 81,20±1,67 0,07±0,01

a ) Удельная активность соответствует нмоль субстрата очищенного/мин/мг фермента. Показанные результаты представляют собой среднее ± стандартное отклонение, полученное из трех отдельных анализов.

Рис.1. Концентрационно-зависимое сульфатирование декстрорфана человеческими SULT1A1, SULT1A3, SULT1C4 и SULT2A1 и 1000 мкМ для SULT1A3 и SULT2A1 и 100, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 и 2000 мкМ для SULT1A1 и SULT1C4.

Рис. 2. Масс-спектрометрический анализ сульфатированного декстрорфана

(A) Полный масс-спектр сульфатированного декстрорфана, выделенного с использованием картриджа Sep-Pak C18. (B) MS2 спектр 336 m / z .

Интересно отметить, что в то время как все четыре SULT человека, сульфатирующие декстрорфан, принадлежат к семейству SULT1, два SULT рыбок данио, ранее показанные как способные сульфатировать декстрорфан, являются членами семейства SULT3. 16) Из двух SULT, сульфатирующих декстрорфан рыбок данио, SULT3 ST1 показал удельную активность 0,89 нмоль/мин/мг, тогда как SULT3 ST3 показал удельную активность 0,10 нмоль/мин/мг. Что касается декстрорфан-сульфатирующей активности, SULT3 ST1 рыбок данио, по-видимому, больше напоминал основной декстрорфан-сульфатирующий SULT человека, SULT1A3 ( cf. Таблица 1). Однако анализ аминокислотной последовательности не выявил особенно высокой гомологии последовательностей между SULT1A3 человека и SULT3 ST1 рыбок данио по сравнению с SULT других рыбок данио (данные не показаны). Таким образом, кажется, что у разных видов сульфатирование декстрорфана может быть опосредовано членами SULT, которые не имеют прямых ортологических филогенетических отношений.

Производство и высвобождение [ 35 S]сульфатированного декстрорфана культивируемыми клетками Caco-2 и клетками HepG2, инкубированными в среде, содержащей [ 35 S]сульфат и различные концентрации декстрорфана

После идентификации человеческих SULT, способных сульфатировать декстрорфан, нас интересовало, действительно ли сульфатирование декстрорфана может происходить в клетках человека.В этом исследовании использовали культивированные клетки Caco-2 и клетки HepG2. Предыдущие исследования выявили экспрессию нескольких ферментов SULT, включая SULT1A1, SULT1A2, SULT1A3, SULT1B1, SULT1C2, SULT1C4 и SULT2A1, в эпителиальных клетках кишечника человека Caco-2. 26) С другой стороны, было показано, что клетки гепатомы человека HepG2 экспрессируют SULT1A1, SULT1A2, SULT1A3, SULT1E1 и SULT2A1. 27,28) Конфлюэнтные клетки Caco-2 и клетки HepG2, выращенные до слияния в разных лунках 24-луночного планшета, инкубировали в бессульфатной среде, содержащей [ 35 S]сульфат и различные концентрации декстрорфана.После 18-часовой инкубации собранные отработанные среды анализировали методом ТСХ. Как показано на рис. 3, значительное количество [ 35 S]сульфатированного декстрорфана было обнаружено в отработанной среде для мечения, содержащей всего 5 мкМ декстрорфана, которое увеличивалось пропорционально увеличению концентрации декстрорфана, добавляемого в среду для мечения. Эти результаты ясно показали, что как клетки Caco-2, так и клетки HepG2 способны метаболизировать декстрорфан путем сульфатирования. Как упоминалось выше, сообщалось, что как клетки HepG2, так и клетки Caco-2 экспрессируют SULT1A3, а также SULT1A1 и SULT2A1, 26–28) , которые способны сульфатировать декстрорфан ( ср. Таблица 1).

Рис. 3. Анализ [ 35 S]сульфатированного декстрорфана, продуцируемого и высвобождаемого эпителиальными клетками кишечника человека Caco-2 и клетками гепатомы человека HepG2, меченными [ 35 S]сульфатом, в присутствии декстрорфана

Confluent Caco- 2 и клетки HepG2 метили [ 35 S]сульфатом в присутствии различных концентраций (0, 5, 10, 25, 50, 100  мкМ) декстрорфана. После 18-часовой инкубации отработанные среды собирали и анализировали с помощью ТСХ.На рисунке показана авторадиограмма, снятая с пластины ТСХ после анализа. Дорожка E соответствует [ 35 S]сульфатированному декстрорфану, полученному ферментативно под действием SULT1A3.

Сульфатирование декстрорфана цитозолями органов человека

Для дальнейшего изучения возможности сульфатирования декстрорфана в органах человека были проведены ферментативные анализы с использованием фракций цитозоля, приготовленных из легких, печени, почек или кишечника человека. В таблице 2 показаны данные об активности, полученные в результате этих анализов.Из четырех протестированных цитозолей органов человека цитозоль, приготовленный из кишечника человека, проявлял самую высокую декстрорфан-сульфатирующую активность, за ним следовали цитозоли, приготовленные из печени и легких человека. В то время как цитозоль, приготовленный из почек, не проявлял определяемой декстрорфан-сульфатирующей активности. Эти результаты означают, что кишечник и печень, вероятно, являются основными органами человека, участвующими в метаболизме декстрорфана посредством сульфатирования. Следует отметить, что, хотя известно, что SULT1A3, основной SULT, сульфатирующий декстрорфан, присутствует в кишечнике на гораздо более высоком уровне, чем в печени, уровень сульфатирующей декстрорфан активности, обнаруженный в образце печени, составил более 50 % от обнаруженного для образца тонкой кишки (таблица 2).Возможно, что все еще значительная активность сульфатирования декстрорфана, обнаруженная в образце печени, могла быть частично обусловлена ​​присутствием других сульфатирующих декстрорфан SULT ( ср. Таблица 1), особенно SULT1A1 и SULT2A1, которые известны. экспрессироваться в печени. 29,30)

Таблица. Печень Почки Тонкий кишечник 0.15±0,05 2,35±0,12 Не обнаружено 4,49±0,19

a ) Удельная активность соответствует пмоль субстрата сульфатированного/мин/мг белка. Показанные результаты представляют собой среднее ± стандартное отклонение, полученное из трех отдельных анализов. Концентрация субстрата, используемого в смеси для анализа, составляла 50 мкМ.

Подводя итог, настоящее исследование показало, что SULT1A3 является основным ферментом SULT человека, способным сульфатировать декстрорфан. Эксперименты с клеточными культурами ясно показали наличие сульфатирования декстрорфана в клетках человека.Кроме того, было показано, что цитозоли кишечника, печени и легких человека способны опосредовать сульфатирование декстрорфана. В совокупности результаты, полученные в настоящем исследовании, предоставили полезную информацию, относящуюся к биохимической основе метаболизма декстрорфана посредством сульфатирования in vitro и in vivo .

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантом Национального института здравоохранения (грант № R03HD071146). Масс-спектрометрию проводили с использованием приборов, расположенных в Лаборатории передового опыта в области фармацевтических исследований Shimadzu в Колледже фармации и фармацевтических наук в кампусе медицинских наук Университета Толедо.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ССЫЛКИ

  • 1) Bem JL, Peck R. Декстрометорфан. Обзор вопросов безопасности. Безвредный для наркотиков. , 7 , 190–199 (1992).
  • 2) Barnhart JW, Massad EN. Определение декстрометорфана в сыворотке крови методом газовой хроматографии. Ж. Хроматогр. Б Биомед. науч. заявл. , 163 , 390–395 (1979).
  • 3) Фоссати А., Вимеркати М.Г., Капуто Р., Валенти М.Фармакологический профиль декстрорфана. Arzneimittel-Forschung , 45 , 1188–1193 (1995).
  • 4) Шадель М., Ву Д., Оттон С.В., Калоу В., Селлерс Э.М. Фармакокинетика декстрометорфана и его метаболитов у человека: влияние фенотипа CYP2D6 и ингибирование хинидина. Дж. Клин. Психофармак. , 15 , 263–269 (1995).
  • 5) Альберс Г.В., Аткинсон Р.П., Келли Р.Е., Розенбаум Д.М., Исследовательская группа декстрорфана. Безопасность, переносимость и фармакокинетика N -антагониста метил-D-аспартата декстрорфана у пациентов с острым инсультом. Инсульт , 26 , 254–258 (1995).
  • 6) Church J, Lodge D, Berry SC. Дифференциальные эффекты декстрорфана и леворфанола на возбуждение спинномозговых нейронов крыс аминокислотами. евро. Дж. Фармакол. , 111 , 185–190 (1985).
  • 7) Франклин П.Х., Мюррей Т.Ф. Высокоаффинное связывание [ 3 H]декстрорфана в мозге крыс локализовано в неконкурентном антагонистическом участке активированного N -метил-D-аспартатного рецептор-катионного канала. Мол. Фармакол. , 41 , 134–146 (1992).
  • 8) Печник Р.Н., Польша РЭ. Сравнение эффектов декстрометорфана, декстрорфана и леворфанола на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось. J. Pharmacol. Эксп. тер. , 309 , 515–522 (2004).
  • 9) Малдер Г.Дж., Джейкоби В.Б. Сульфатирование в реакциях сопряжения. Метаболизм лекарственных средств . (Малдер Г.Дж., редакторы Джейкоби В.Б.) Тейлор и Фрэнсис, Лондон, стр. 107–161 (1990).
  • 10) Фалани К.Н., Рот Дж.А.Свойства цитозольных сульфотрансфераз человека, участвующих в метаболизме лекарственных средств. Метаболизм лекарственных средств человека: от молекулярной биологии к человеку . (изд. Джеффри Э.Х.) CRC Press, Бока-Ратон, стр. 101–115 (1993).
  • 11) Вейншилбоум Р., Оттернесс Д.М. Реакции конъюгации-деконъюгации фермента сульфотрансферазы. Реакции конъюгации-деконъюгации в метаболизме и токсичности лекарственных средств . (изд. Kaufman FC) Springer-Verlag, Berlin, стр. 45–78 (1994).
  • 12) Липманн Ф. Биологическая активация и перенос сульфатов. Наука , 128 , 575–580 (1958).
  • 13) Стротт, Калифорния. Сульфирование и молекулярное действие. Эндокр. , 23 , 703–732 (2002).
  • 14) Yamazoe Y, Nagata K, Ozawa S, Kato R. Структурное сходство и разнообразие сульфотрансфераз. Хим. биол. Взаимодействовать. , 92 , 107–117 (1994).
  • 15) Бланшар Р.Л., Фреймут Р.Р., Бак Дж., Вейншилбум Р.М., Каутри М.В. Предлагаемая система номенклатуры для надсемейства цитозольных сульфотрансфераз (SULT). Фармакогенетика , 14 , 199–211 (2004).
  • 16) Куроги К., Диллон Дж., Нассер А., Лю М.Ю., Уильямс Ф.Е., Сакакибара Ю., Суйко М., Лю М.К. Сульфатирование лекарственных соединений цитозольными сульфотрансферазами рыбок данио (SULT). Препарат Метаб. лат. , 4 , 62–68 (2010).
  • 17) Сакакибара Ю., Таками Ю., Накаяма Т., Суйко М., Лю М.С. Локализация и функциональный анализ субстратной специфичности/каталитических доменов М-формы и Р-формы фенолсульфотрансфераз человека. J. Biol. хим. , 273 , 6242–6247 (1998).
  • 18) Сакакибара Ю., Янагисава К., Катафути Дж., Рингер Д.П., Таками Ю., Накаяма Т., Суйко М., Лю М.С. Молекулярное клонирование, экспрессия и характеристика новой сульфотрансферазы SULT1C человека, которая катализирует сульфирование N -гидрокси-2-ацетиламинофлуорена. J. Biol. хим. , 273 , 33929–33935 (1998).
  • 19) Суйко М., Сакакибара Ю., Лю М.С. Сульфатирование эстрогеноподобных химических веществ из окружающей среды цитозольными сульфотрансферазами человека. Биохим. Биофиз. Рез. коммун. , 267 , 80–84 (2000).
  • 20) Пай Т.Г., Сугахара Т., Суйко М., Сакакибара Ю., Сюй Ф., Лю М.С. Дифференциальная ксеноэстрогенсульфатирующая активность цитозольных сульфотрансфераз человека: молекулярное клонирование, экспрессия и очистка сульфотрансфераз SULT2B1a и SULT2B1b человека. Биохим. Биофиз. Acta , 1573 , 165–170 (2002).
  • 21) Сакакибара Ю., Суйко М., Пай Т.Г., Накаяма Т., Таками Ю., Катафути Д., Лю М.С.Высококонсервативные сульфотрансферазы мозга мыши и человека: молекулярное клонирование, экспрессия и функциональная характеристика. Ген , 285 , 39–47 (2002).
  • 22) Янагисава К., Сакакибара Ю., Суйко М., Таками Ю., Накаяма Т., Накадзима Х., Такаянаги К., Натори Ю., Лю М.С. Клонирование кДНК, экспрессия и характеристика бифункционального фермента АТФ-сульфурилазы/аденозин-5′-фосфосульфаткиназы человека. Бионауч. Биотехнолог. Биохим. , 62 , 1037–1040 (1998).
  • 23) Фаланы ЧН. Энзимология цитозольных сульфотрансфераз человека. FASEB J. , 11 , 206–216 (1997).
  • 24) Дули Т.П., Холдеман-Кахилл Р., Джойнер Дж., Уилборн Т.В. Профилирование экспрессии надсемейств генов сульфотрансферазы и сульфатазы человека в эпителиальных тканях и культивируемых клетках. Биохим. Биофиз. Рез. коммун. , 277 , 236–245 (2000).
  • 25) Стэнли Э.Л., Хьюм Р., Каутри М.В. Профилирование экспрессии цитозольной сульфотрансферазы плода человека, участвующей в метаболизме стероидов и гормонов щитовидной железы, а также в детоксикации. Мол. Клетка. Эндокринол. , 240 , 32–42 (2005).
  • 26) Teubner W, Meinl W, Florian S, Kretzschmar M, Glatt H. Идентификация и локализация растворимых сульфотрансфераз в желудочно-кишечном тракте человека. Биохим. J. , 404 , 207–215 (2007).
  • 27) Miyano J, Yamamoto S, Hanioka N, Narimatsu S, Ishikawa T, Ogura K, Watabe T, Nishimura M, Ueda N, Naito S. Участие SULT1A3 в повышенном сульфатировании 4-гидроксипропранолола в клетках Hep G2, предварительно обработанных β-нафтофлавон. Биохим. Фармакол. , 69 , 941–950 (2005).
  • 28) Westerink WMA, Schoonen WGEJ. Уровни ферментов фазы II в клетках HepG2 и криоконсервированных первичных гепатоцитах человека и их индукция в клетках HepG2. Токсикол. In Vitro , 21 , 1592–1602 (2007).
  • 29) Баркер Э.В., Хьюм Р., Халлас А., Каутри В.Х. Дегидроэпиандростеронсульфотрансфераза в развивающемся плоде человека: количественная биохимическая и иммунологическая характеристика ферментов печени, почек и надпочечников. Endocrinology , 134 , 982–989 (1994).
  • 30) Ричард К., Хьюм Р., Каптейн Э., Стэнли Э.Л., Виссер Т.Дж., Каутри М.В. Сульфатирование гормонов щитовидной железы и дофамина в процессе развития человека: онтогенез фенолсульфотрансфераз и арилсульфатаз в печени, легких и головном мозге. Дж. Клин. Эндокринол. Метаб. , 86 , 2734–2742 (2001).

Сульфатирование тирозина преобладает в рецепторах хемокинов человека, что важно при заболеваниях легких

Наше понимание явлений, которые инициируют и способствуют хроническому воспалению при астме и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), меняется с признанием того, что хемокины играют центральную роль в их патогенезе (

).Данные, полученные на животных моделях и людях, показывают, что лейкоциты и мононуклеарные клетки играют решающую роль в опосредовании воспаления, лежащего в основе астмы и ХОБЛ, при которых адаптивные иммунные реакции становятся и остаются аномальными. Хемокиновые рецепторы на мононуклеарных клетках и лейкоцитах опосредуют перенос, активацию и дифференцировку воспалительных клеток, но как хемокиновые рецепторы взаимодействуют с хемокинами

). Хемокиновые рецепторы человека представляют собой семейство из 18 семитрансмембранных (7TM) рецепторов, связанных с G-белком, которые связываются с разнообразной группой хемокиновых лигандов (

).В отличие от большинства рецепторов 7TM, хемокиновые рецепторы обладают широкой и перекрывающейся специфичностью в отношении своих хемокиновых лигандов и экспрессируются на различных лейкоцитах (

). Лейкоциты реагируют на специфические хемокины, определяемые тем, какой рецептор(ы) хемокинов они экспрессируют на своих клеточных мембранах.

Хемокиновые рецепторы, важные при астме, включают сульфатированные (CCR2, CCR5, CCR8, CXCR3 и CXCR4) и неизвестные сульфатированные (CCR1, CCR3, CCR4, CXCR1 и CXCR2) (1, 3).Информация о сульфатировании этих хемокиновых рецепторов может пролить свет на неизвестные взаимодействия хемокинов и хемокиновых рецепторов, ведущие к развитию дополнительных агонистов/антагонистов рецепторов. Обнаружение экспериментальных данных о сульфатировании тирозина подтверждает гипотезу о том, что сульфатирование тирозина играет важную роль в функционировании этих важнейших белков (5, 6). Здесь мы вычисляем данные последовательности, чтобы увидеть, вероятно ли, что такие экспериментальные доказательства могут быть в конечном итоге найдены, и определить, в каких остатках тирозина такие доказательства, скорее всего, будут обнаружены.Это превращает общую гипотезу о сульфатировании тирозина этих белков в более конкретное и легко проверяемое предсказание о конкретных остатках.

Сульфатирование тирозина представляет собой селективную посттрансляционную модификацию белков, включающую добавление отрицательно заряженной сульфатной группы к открытому остатку тирозина с образованием тирозил-О-сульфата. Тирозильные протеинсульфотрансферазы (TPST), которые катализируют эту реакцию, локализованы в транс -Гольджи (7). Huttner и Baueerle подсчитали, что сульфатирование тирозинов происходит примерно в 1% всех тирозинов в эукариотических белках (7), основываясь на данных Drosophila , доступных 25 лет назад.В настоящее время известно только 70 белков, содержащих сульфатированные тирозины, а 89 отдельных сульфатированных тирозинов были идентифицированы экспериментально. Из этих участков тирозина было замечено, что отрицательно заряженные кислотные остатки часто граничат с сульфатированными тирозинами, и что сульфатированные тирозины часто группируются в четко определенные кластеры. Таким образом, основными детерминантами сульфатирования тирозина являются наличие отрицательно заряженных кислых аминокислотных остатков и вторичная и третичная структура белка, которая, вероятно, способствует сульфатированию, подвергая соседние тирозины воздействию TPST (8).

Экспериментально подтверждено наличие сульфатированных тирозинов только в пяти рецепторах хемокинов человека: CXCR3, CXCR4, CCR2b, CCR5 и CX3CR1 (5, 9–12) и в одном мышином рецепторе, CCR8 (13). Было показано, что сульфатированные тирозины в каждом из пяти рецепторов хемокинов человека находятся на N-конце, белковом домене, имеющем решающее значение для высокой аффинности связывания (12, 14–17). Сульфатированные тирозины и фланкирующие их кислые аминокислотные остатки необходимы для оптимального связывания хемокинов в CXCR4, CCR2b и CCR5. После мутагенеза любого из этих ключевых остатков все рецепторы продемонстрировали значительное снижение связывания (16, 18, 19).Из-за корреляции между сульфатированными тирозинами и связыванием хемокиновых рецепторов мы проанализировали все хемокиновые рецепторы с помощью нашей новейшей позиционно-специфической оценочной матрицы (PSSM), которая включает данные для экспериментально подтвержденных сайтов сульфатирования тирозина хемокиновых рецепторов, чтобы предсказать существование сульфатирования тирозина. участки хемокиновых рецепторов. Делая гипотезу о сульфатировании более специфичной и более легко тестируемой для каждого хемокинового рецептора, эти прогнозы могут пролить свет на взаимодействие хемокинового рецептора с лигандом, имеющее отношение к воспалительной реакции и заболеванию.

ОБСУЖДЕНИЕ

Раздел:

ВыбратьВерх страницыАннотацияМАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ <<СсылкиЦитируя статьи

Хемокиновые рецепторы экспрессируются лейкоцитами, мононуклеарными клетками, эпителиальными клетками дыхательных путей и гладкомышечными клетками нижних дыхательных путей. Лейкоциты и мононуклеарные клетки играют решающую роль в опосредовании воспаления, лежащего в основе астмы и ХОБЛ, при которых адаптивные иммунные реакции становятся и остаются аномальными. Открытие хемокина CCL11/eotaxin и его хемокинового рецептора CCR3 привело к новой оценке роли хемокинов и их рецепторов при астме (22).Активация CCR3 привлекает ключевые воспалительные клетки, такие как эозинофилы, в дыхательные пути при обоих заболеваниях легких. CXCR3 как медиатор хемотаксиса тучных клеток также является важным рецептором при астме (23). Кроме того, CCR4- и CCR8-опосредованное рекрутирование Th3-клеток может быть связано с развитием астмы (1, 24, 25). CXCR1 и CXCR2 являются рецепторами нейтрофилов для хемокинов CXC (например, CXCL8/IL-8), важных при ХОБЛ (25) и, возможно, при астме у взрослых, при которой нейтрофилы более разрушительны.

Наш прогноз состоит в том, что сульфатирование тирозина в хемокиновых рецепторах при астме и ХОБЛ более распространено, чем известно в настоящее время. В дополнение к 5 хемокиновым рецепторам с известными сульфатированными тирозинами мы прогнозируем, что 11 других хемокиновых рецепторов содержат сульфатированные тирозины, включая 3 рецептора с оценкой от 1,5 до 2,5. Некоторые из предсказанных участков сгруппированы, и большинство из них высоко консервативны среди различных видов млекопитающих. Оба этих качественных признака характерны для известных участков сульфатирования тирозина и подтверждают наши предсказания.Все, кроме трех, предсказанные тирозиновые сайты расположены во внеклеточном N-терминальном домене, где происходят взаимодействия хемокинового рецептора с лигандом in vivo . Другие три предсказанных сайта расположены во второй внеклеточной петле, хотя экспериментальные данные не подтверждают наличие сульфатированных тирозинов в этой петле CCR5, месте одного из наших предсказаний (5).

Недавние исследования показывают, что две сульфотрансферазы имеют перекрывающиеся, но разные ферментативные профили и субстратную специфичность.Например, TPST имеют разные оптимальные значения pH и концентрации Mn 2+ (26). TPST-2 также стимулируется ионами Mg 2+ , тогда как TPST-1 нет, и паттерны экспрессии двух изоферментов значительно различаются в разных тканях. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что субстратные специфичности двух TPST не полностью повторяются. Действительно, две линии мышей с нокаутом TPST имеют разные мутантные фенотипы: мыши TPST-1 -/- имеют умеренно сниженную массу тела и плодовитость, в то время как мыши TPST-2 -/- имеют значительно более медленные темпы роста и сниженную мужскую фертильность. по сравнению с диким типом (27).Мутация в TPST2, приводящая к потере активности TPST2, вызывает отсутствие сульфатирования и передачи сигналов в TSHR, что приводит к гипотиреозу у мышей (28). Поскольку PSSM был разработан для сравнения только аминокислотных последовательностей, не ожидалось, что он будет включать дополнительные структурные особенности, которые могли бы повлиять на специфичность субстрата фермента.

Однако существует несколько ограничений, присущих применению PSSM к аминокислотным последовательностям хемокинов. Во-первых, PSSM строится из 89 известных сайтов.Предыдущие оценки распространенности сульфатирования, проведенные Муром, показали, что до 7% всех мышиных белков могут быть сульфатированы по тирозину (27). Если эта оценка верна, 41 белок с известными сайтами сульфатирования (из 70 опубликованных сульфатированных белков), использованных в PSSM, будут представлять собой лишь очень небольшую выборку фактического общего количества белков. Другим ограничением является смещение отбора в сторону сайтов с кислотными остатками в PSSM. Из известных сайтов 44% имеют аспартат и 17% имеют глутамат в положении -1 по отношению к тирозину (Y-1).Несколько известных сайтов сульфатирования тирозина в пептидах, таких как энкефалин и филлокинин, только с основными остатками и без кислотных остатков, не включены в PSSM, поскольку может существовать второй, неизвестный механизм распознавания этих основных сайтов. Поскольку разные значения K m и V max (константа диссоциации и максимальная скорость соответственно) в TPST-1 и TPST-2 подразумевают, что эти два фермента имеют разные требования к распознаванию субстрата (26), один из этих TPST могут сульфатировать основные сайты лучше, чем другие.

Другая проблема с нашим прогнозом мест сульфатирования тирозина заключается в том, что одно место в некоторых регионах, богатых тирозином, может иметь гораздо более высокие баллы, чем соседнее место. Например, некоторые сайты тирозина в выравнивании CCR3 (рис. 2А) имеют низкие баллы. Даже при более низких баллах эти сайты демонстрируют весьма консервативную замену аминокислот с сохранением их физико-химических свойств. Поскольку PSSM не принимает во внимание соседний сульфатированный тирозин, тирозин, близкий к этому сульфатированному тирозину, может иметь более высокую вероятность сульфатирования, чем указывает оценка прогноза.

Присутствие кислотного остатка в положении Y-1 является обычным явлением в известных сайтах, так как 61% этих сайтов содержат либо глутаминовую кислоту, либо аспарагиновую кислоту в этом положении. Эти кислотные остатки не только увеличивают частоту сульфатирования тирозина, но также могут усиливать связывание сульфатированного белка с его лигандом. В экспериментах с гастрином в клеточной линии HIT мутация аланина Y-1 в аспартат увеличивает сульфатирование тирозина с 60 до 100% (29). В исследовании ядерного магнитного резонанса (ЯМР) пептида CXCR1, образующего комплекс с CXCL1/IL-8, кислотные остатки непосредственно на N-конце предсказанного Y27 взаимодействуют с остатками лизина и аргинина в хемокине.Ожидается, что эти взаимодействия будут увеличивать аффинность связывания рецептор-лиганд (30).

Консервация сайтов сульфатирования тирозина, хотя и несовершенная, предполагает некоторую фундаментальную роль сульфатирования тирозина, которая является благоприятной для эволюции. Отсутствие определенных закономерностей в тирозиновых сайтах различных рецепторов хемокинов человека приводит к большим пробелам в выравнивании, показанном на рисунке 1. Тем не менее, предсказанные сульфатированные тирозины обычно сохраняются в положении, которое соответствует Y18 CXCR1.Хотя отрицательный заряд сульфатированного тирозина может просто усиливать взаимодействие хемокинового рецептора с лигандом, сохранение локализованного сайта сульфатирования тирозина предполагает, что эта область жизненно важна для функции хемокинового рецептора.

Выравнивание одного хемокинового рецептора, CCR3, у пяти видов млекопитающих (рис. 2) показывает лучшую сохранность сайтов, чем выравнивание всех хемокиновых рецепторов человека (рис. 1), как и ожидалось. В этом выравнивании Y16 из CCR3 человека консервативен во всех последовательностях, кроме собаки.Обратите внимание, что в каждом случае предсказанный тирозин, а также фланкирующие остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот должны образовывать отрицательный участок, дополняющий основные остатки в хемокинах, с которыми они связываются. В дополнение к сульфатированному тирозину аминокислотная последовательность сайта сульфатирования тирозина, вероятно, влияет на специфичность хемокинового рецептора, поскольку большинство хемокиновых рецепторов могут связывать несколько различных хемокинов.

Все больше данных свидетельствует о том, что сульфатирование тирозина рецепторов хемокинов играет жизненно важную роль в связывании хемокиновых рецепторов и лигандов и передаче сигналов.В CCR3 предполагаемые сайты сульфатирования тирозина расположены на N-конце и второй внеклеточной петле, белковых доменах, критических для связывания и активации рецептора (31). Кроме того, наблюдения ЯМР показывают, что предсказанные тирозины Y27 и Y17 в N-концевых фрагментах CXCR1 и CCR3 связываются посредством гидрофобных взаимодействий со своими соответствующими лигандами, CXCL8/IL-8 и CCL11/эотаксином (30, 32). Если эти тирозины сульфатированы и действуют аналогично таковым в известных сульфатированных белках, можно ожидать электростатических взаимодействий (солевых мостиков) и Н-связей между сульфонатом и лигандами хемокинов.Например, Y21 пептида CXCR4, единственного сульфатированного хемокинового рецептора, специфическое связывание которого известно, участвует в электростатическом взаимодействии с сайтом в CXCL12/SDF-1, включая аргинин (33). В модели сульфатированного CXCR1, основанной на приведенной выше структуре ЯМР, Y27 и соседний остаток аспартата участвуют в Н-связях с лизинами в лиганде CXCL8/IL-8 (данные не показаны). В каждом случае кислотные остатки, окружающие тирозины, структурно дополняют гидрофобную бороздку, граничащую с основными остатками на хемокиновых лигандах (34).Таким образом, экспериментальные данные, где известно, что происходит сульфатирование тирозина, показывают сильную связь между сульфатированием тирозина и связыванием лиганда, хотя эксперименты in vitro с CCR2b и CX3CR1 предполагают, что сульфатирование также может быть важным для внутриклеточной передачи сигналов (10, 11). Паттерн и расположение остатков тирозина, которые, по нашим прогнозам, сульфатируются в хемокиновых рецепторах, позволяют предположить, что предсказанные сайты могут играть роль в увеличении связывания с их лигандами, подобно известным сайтам сульфатирования (, см. , табл. 2).Эта роль в опосредовании взаимодействия и связывания с лигандами согласуется с ролью сульфатирования тирозина в других биологических системах. Сульфатирование тирозина опосредует белок-белковые взаимодействия и связывание в таких процессах, как коагуляция, лизис бактерий и антикоагуляция (27).

Эффект Подробности548

ТАБЛИЦА 2. ОСОБЫЕ ЭФФЕКТЫ тирозина сульфатации




рецептора хемокинов



Артикул
Повышена связывание хемокинов CMV US28 Вирусный рецептор CMV US28: Увеличение привязки к CCL3 * , CCL4 , CCL5 , CX3CL1 § , CX3CL1 § (45)
Увеличение связывания хемокинов CXCR3 рецептор CXCR3: Увеличение привязки к CXCL9 , CXCL10 ** , CXCL11 † † (12) (12) (12)
CXCR4 рецептор CXCR4: увеличение связывания с CXCL12 (9)
CCR2b Рецептор CCR2b: повышенное связывание с CCL2 §§ (10)
CCR5 рецептор CCR5: увеличение привязки к CCL3 * , CCL4 , и CCL5 (5,46) (5,46) (5,46)
Увеличение связывания с хемокином / молекул адгезии CX3CR1 рецептор CX3CR1: повышенная твердая адгезия к CX3CL1 (11)0 (11)
CXCR3 CXCR3 рецептор CXCR3: повышает хемотаксис после связывания с CXCL9 , CXCL10 †† , и CXCL11 †† (12) (12)
Повышенные сигнализации / нисходящие события CCR2B рецептор CCR2B: увеличен CA ++ Приток и хемотаксис после привязки к CCL2 §§ (10)
CX3CR1
Рецептор CX3CR1: увеличение притока Ca ++ после связывания с CXC3L1 Роль сульфатирования тирозина в патогенезе таких заболеваний, как СПИД, становится все более документированной.Сульфатирование тирозина имеет решающее значение для инфицирования Т-клеток ВИЧ-1 через главный корецептор CCR5, хотя, по-видимому, не требуется для меньшего корецептора CXCR4 (5, 9). Хотя было высказано предположение, что все хемокиноподобные корецепторы ВИЧ-1 сульфатированы по тирозину (5), точный механизм проникновения вируса через сульфатированные хемокиновые рецепторы до конца не ясен. Согласно преобладающей теории, ВИЧ имитирует электростатические взаимодействия, которые облегчают связывание хемокинового лиганда с рецептором. Таким образом, тирозиновое сульфатирование корецепторов ВИЧ приводит к образованию участков отрицательно заряженных остатков.Затем отрицательно заряженные участки усиливают связывание рецептора с гликопротеином оболочки ВИЧ (gp120), который, как известно, содержит консервативный аргинин R-298, необходимый для вирусной инфекции (35). Подобные механизмы могут использоваться антителами против gp120 для нейтрализации ВИЧ-инфекции. Эти антитела обнаруживают тирозил-O-сульфат или имеют остатки, которые очень благоприятны для сульфатирования тирозина (6). В некоторых антителах рентгеноструктурный анализ показал, что сульфатированные тирозины вступают в непосредственный контакт и связываются с gp120, предполагая, что сульфатирование тирозина имеет решающее значение для распознавания антигена и связывания вируса (36).Сульфатированный тирозином пептид, полученный из тяжелой цепи антитела, нейтрализующего ВИЧ-1, связывает gp120 и ингибирует инфекцию ВИЧ-1 (37). Область будущих поступательных клинических исследований с большим потенциалом будет включать нацеливание тирозил-О-сульфата на корецепторы ВИЧ, тем более что наши прогнозы PSSM показывают, что корецепторы ВИЧ CCR3, CCR8, CXCR6, D6 и DEZ сульфатированы по тирозину, подобно N-концевым рецепторам. сайты в CCR5 (данные не показаны).

В патобиологии астмы клетки Th3, тучные клетки, эозинофилы и эпителиальные клетки играют важную роль в возникновении стойкого воспаления дыхательных путей.Подтверждено, что некоторые хемокиновые рецепторы человека, экспрессируемые на этих клетках, являются сульфатированными по тирозину, такие как CCR2, CXCR3, CXCR4 и CX3CR1, в то время как некоторые предсказаны, но не подтверждены, например, CCR1, CCR3, CCR4 и CCR8 (12, 24, 38). ). Тучные клетки, в частности, играют решающую роль при астме. Гиперреактивность дыхательных путей сильно коррелирует с количеством тучных клеток в гладких мышцах легких (23). Недавнее открытие того, что CXCR3, экспрессируемый подгруппой тучных клеток легких человека (39), подвергается сульфатированию тирозина, имеет важное значение (12), поскольку сульфатирование тирозина необходимо для связывания трех хемокинов — CXCL9 (MIG), CXCL10 (IL-10). ) и CXCL11 (I-TAC), а также интернализация рецептора и хемотаксис.Когда Y27 и Y29 мутируют в аланин, хемотаксиса при добавлении хемокинов в среду не наблюдается. Прогениторы тучных клеток экспрессируют хемокиновые рецепторы CCR3, CCR5, CCR2 и CXCR4, хотя для миграции из костного мозга необходим только CXCR4 (40). Недавно Sutcliffe и соавт. показали, что CCR3 и CCR1 необходимы для миграции в гладкие мышцы дыхательных путей (41). Ожидается, что, подобно CXCR3, предполагаемые сайты сульфатирования тирозина в CCR1, CCR3 и CCR4 увеличивают связывание с соответствующими лигандами и усиливают миграцию тучных клеток (12).

Значительная часть фармацевтических исследований и разработок, направленных на модулирование воспаления при астме и ХОБЛ, сосредоточена на антагонистах хемокиновых рецепторов (25, 42). Модуляция сетей специфических хемокиновых лигандов-рецепторов, необходимая для переноса лейкоцитов и последующих воспалительных событий, важна для контроля астмы и ХОБЛ (25). Противодействие хемокинам/хемокиновым рецепторам осложняется их перекрывающейся функцией и специфичностью связывания, хотя несколько многообещающих низкомолекулярных антагонистов хемокиновых рецепторов, таких как CCR5 и CXCR4, находятся на стадии 2 или 3 испытаний (43).Предсказания, представленные выше, открывают возможность того, что сульфатирование тирозина может быть даже более широко распространено среди рецепторов хемокинов, чем считалось ранее. Рассмотрение этих сульфатированных тирозинов при структурном дизайне специфических антагонистов рецепторов может привести к более точному нацеливанию на рецепторы хемокинов и эффективной лекарственной терапии астмы, ХОБЛ и подобных воспалительных заболеваний легких.

1. Панина-Бординьон П., Д’Амброзио Д. Хемокины и их рецепторы при астме и хронической обструктивной болезни легких. Curr Opin Pulm Med 2003; 9:104–110.
2. Olson TS, Ley K. Хемокины и хемокиновые рецепторы в транспортировке лейкоцитов. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2002; 283: R7–R28.
3. Smit JJ, Lukacs NW. Более пристальный взгляд на хемокины и их роль в астматических реакциях. Eur J Pharmacol 2006; 533:277–288.
4. Мерфи П.М., Баджолини М., Чаро И.Ф., Хеберт К.А., Хорук Р., Мацусима К., Миллер Л.Х., Оппенгейм Дж.Дж., Пауэр К.А.Международный союз фармакологов: XXII. Номенклатура хемокиновых рецепторов. Pharmacol Rev 2000; 52:145–176.
5. Фарзан М., Мирзабеков Т., Колчинский П., Вятт Р., Каябьяб М., Джерард Н.П., Джерард С., Содроски Дж., Чой Х. Сульфатирование тирозина амино-конца CCR5 облегчает проникновение ВИЧ-1. Сотовый 1999; 96: 667–676.
6. Чоу Х., Ли В., Райт П.Л., Васильева Н., Вентури М., Хуанг К.С., Грунднер К., Дорфман Т., Цвик М.Б., Ван Л., и др. Сульфатирование тирозина антител человека способствует распознаванию области связывания CCR5 gp120 ВИЧ-1. Сотовый 2003; 114:161–170.
7. Huttner W, Baeuerle P. Сульфатирование белка на тирозине. Mol Cell Biol 1988; 6:97–140.
8. Николас Х.Б. мл., Чан С.С., Розенквист Г.Л. Переоценка детерминант сульфатирования тирозина. Эндокринная система 1999; 11:285–292.
9. Фарзан М., Бэбкок Г.Дж., Васильева Н., Райт П.Л., Киприлов Э., Мирзабеков Т., Чой Х. Роль посттрансляционных модификаций амино-конца CXCR4 в ассоциации стромального фактора 1 альфа и проникновении ВИЧ-1. J Biol Chem 2002; 277:29484–29489.
10. Преображенский А.А., Драган С., Кавано Т., Гаврилин М.А., Гулина И.В., Чакраварти Л., Колаттукуды П.Е. Рецептор хемотаксического белка-1 моноцитов CCR2B представляет собой гликопротеин, который имеет сульфатирование тирозина в консервативной внеклеточной n-концевой области. J Immunol 2000;165:5295–5303.
11. Фонг А.М., Алам С.М., Имаи Т., Харибабу Б., Патель Д.Д. Сульфатирование тирозина CX3CR1 усиливает адгезию клеток, индуцированную фракталкином. J Biol Chem 2002;277:19418–19423.
12. Колвин Р.А., Кампанелла Г.С., Манис Л.А., Ластер А.Д. CXCR3 требует сульфатирования тирозина для связывания лиганда и второго аргининового остатка внеклеточной петли для индуцированного лигандом хемотаксиса. Mol Cell Biol 2006; 26:5838–5849.
13. Gutierrez J, Kremer L, Zaballos A, Goya I, Martinez AC, Marquez G. Анализ посттрансляционных модификаций CCR8 и их влияние на активность рецепторов. J Biol Chem 2004; 279:14726–14733.
14. Доранц Б.Дж., Орсини М.Дж., Тернер Д.Д., Хоффман Т.Л., Берсон Д.Ф., Хокси Д.А., Пайпер С.К., Брасс Л.Ф., Домс Р.В. Идентификация доменов CXCR4, которые поддерживают функции корецепторов и хемокиновых рецепторов. J Virol 1999;73:2752–2761.
15. Монтекларо Ф.С., Чаро И.Ф. Аминоконцевой внеклеточный домен рецептора MCP-1, но не рецептор Rantes/MIP-1alpha, обеспечивает селективность в отношении хемокинов: свидетельство двухэтапного механизма активации рецептора MCP-1. J Biol Chem 1996; 271:19084–19092.
16. Blanpain C, Doranz BJ, Vakili J, Rucker J, Govaerts C, Baik SS, Lorthioir O, Migeotte I, Libert F, Baleux F, et al. Множественные заряженные и ароматические остатки в амино-концевом домене CCR5 участвуют в высокоаффинном связывании как хемокинов, так и белка env ВИЧ-1. J Biol Chem 1999; 274:34719–34727.
17. Mizoue LS, Bazan JF, Johnson EC, Handel TM. Структура раствора и динамика хемокинового домена CX3C фракталкина и его взаимодействие с N-концевым фрагментом CX3CR1. Биохимия 1999;38:1402–1414.
18. Брело А., Хевекер Н., Монтес М., Ализон М. Идентификация остатков CXCR4, критических для активности корецептора вируса иммунодефицита человека и хемокинового рецептора. J Biol Chem 2000;275:23736–23744.
19. Hemmerich S, Paavola C, Bloom A, Bhakta S, Freedman R, Grunberger D, Krstenansky J, Lee S, McCarley D, Mulkins M, et al. Идентификация остатков хемотаксического белка-1 моноцитов, которые контактируют с рецептором MCP-1, CCR2. Биохимия 1999;38:13013–13025.
20. Do CB, Mahabhashyam MS, Brudno M, Batzoglou S. Probcons: множественное выравнивание последовательностей на основе вероятностной согласованности. Genome Res 2005; 15:330–340.
21. Wallace IM, O’Sullivan O, Higgins DG, Notredame C. M-coffee: сочетание нескольких методов выравнивания последовательностей с t-coffee. Nucleic Acids Res 2006; 34:1692–1699.
22. Ponath PD, Qin S, Post TW, Wang J, Wu L, Gerard NP, Newman W, Gerard C, Mackay CR. Молекулярное клонирование и характеристика рецептора эотаксина человека, селективно экспрессируемого на эозинофилах. J Exp Med 1996;183:2437–2448.
23. Brightling CE, Bradding P, Symon FA, Holgate ST, Wardlaw AJ, Pavord ID. Инфильтрация тучными клетками гладких мышц дыхательных путей при астме. N Engl J Med 2002;346:1699–1705.
24. Биссет Л.Р., Шмид-Грендельмайер П. Хемокины и их рецепторы в патогенезе аллергической астмы: прогресс и перспективы. Curr Opin Pulm Med 2005; 11:35–42.
25. Charo IF, Ransohoff RM.Многочисленные роли хемокинов и хемокиновых рецепторов в воспалении. N Engl J Med 2006; 354:610–621.
26. Mishiro E, Sakakibara Y, Liu MC, Suiko M. Дифференциальные ферментативные характеристики и тканеспецифическая экспрессия TPST-1 и TPST-2 человека. J Biochem (Токио) 2006; 140:731–737.
27. Мур КЛ. Биология и энзимология O-сульфатирования тирозина белка. J Biol Chem 2003; 278:24243–24246.
28. Sasaki N, Hosoda Y, Nagata A, Ding M, Cheng JM, Miyamoto T, Okano S, Asano A, Miyoshi I, Agui T. Мутация в TPST2, кодирующем тирозилпротеинсульфотрансферазу, вызывает карликовость, связанную с гипотиреозом . Мол Эндокринол 2007; 24:24.
29. Бундгаард Дж.Р., Вууст Дж., Рехфельд Дж.Ф. О-сульфатирование тирозина способствует протеолитическому процессингу прогастрина. EMBO J 1995; 14:3073–3079.
30. Skelton NJ, Quan C, Reilly D, Lowman H. Структура фрагмента хемокинового рецептора CXC в комплексе с интерлейкином-8. Структура 1999; 7:157–168.
31. Pease JE, Wang J, Ponath PD, Murphy PM. N-концевые внеклеточные сегменты хемокиновых рецепторов CCR1 и CCR3 являются детерминантами для связывания MIP-1alpha и эотаксин, соответственно, но второй домен необходим для эффективной активации рецептора. J Biol Chem 1998;273:19972–19976.
32. Ye J, Kohli LL, Stone MJ. Характеристика связывания между хемокиновым эотаксином и пептидами, полученными из хемокинового рецептора CCR3. J Biol Chem 2000; 275:27250–27257.
33. Veldkamp CT, Seibert C, Peterson FC, Sakmar TP, Volkman BF. Распознавание сульфотирозина CXCR4 хемокиновым стромальным клеточным фактором-1альфа (SDF-1альфа/CXCL12). J Mol Biol 2006;359:1400–1409.
34. Blanpain C, Doranz BJ, Bondue A, Govaerts C, De Leener A, Vassart G, Doms RW, Proudfoot A, Parmentier M. Основной домен хемокинов связывает внеклеточные домены CCR5, в то время как их амино-конец взаимодействует с пучком трансмембранной спирали. J Biol Chem 2003;278:5179–5187.
35. Wang WK, Dudek T, Zhao YJ, Brumblay HG, Essex M, Lee TH. Использование корецептора Ccr5 включает высококонсервативный остаток аргинина gp120 ВИЧ типа 1. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:5740–5745.
36. Huang CC, Venturi M, Majeed S, Moore MJ, Phogat S, Zhang MY, Dimitrov DS, Hendrickson WA, Robinson J, Sodroski J, et al. Структурная основа сульфатирования тирозина и использование гена VH в антителах, распознающих сайт связывания корецептора ВИЧ 1 типа на gp120. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:2706–2711.
37. Dorfman T, Moore MJ, Guth AC, Choe H, Farzan M. Тирозин-сульфатированный пептид, полученный из области CDR3 тяжелой цепи антитела, нейтрализующего ВИЧ-1, связывает gp120 и ингибирует ВИЧ- 1 инфекция. J Biol Chem 2006; 281:28529–28535.
38. Барнс П.Дж. Лекарства от астмы. BrJ Pharmacol 2006;147:S297–S303.
39. Brightling CE, Ammit AJ, Kaur D, Black JL, Wardlaw AJ, Hughes JM, Bradding P. Ось CXCL10/CXCR3 опосредует миграцию тучных клеток легких человека в астматические гладкие мышцы дыхательных путей. Am J Respir Crit Care Med 2005;171:1103–1108.
40. Лин Т.Дж., Иссекутц Т.Б., Маршалл Дж.С.Тучные клетки человека трансмигрируют через эндотелиальные монослои пупочной вены человека и селективно продуцируют IL-8 в ответ на фактор-1 альфа, полученный из стромальных клеток. J Immunol 2000;165:211–220.
41. Сатклифф А., Каур Д., Пейдж С., Вудман Л., Армор С.Л., Баракет М., Брэддинг П., Хьюз Дж.М., Брайтлинг К.Е. Миграция тучных клеток в Th3 стимулирует гладкую мускулатуру дыхательных путей у астматиков. Грудная клетка 2006; 61: 657–662.
42. Элснер Дж., Эшер С.Е., Форссманн Ю.Антагонисты хемокиновых рецепторов: новый терапевтический подход при аллергических заболеваниях. Аллергия 2004;59:1243–1258.
43. Allen SJ, Crown SE, Handel TM. Хемокин: структура рецептора, взаимодействия и антагонизм. Annu Rev Immunol 2007; 25:787–820.
44. Ю Ю, Хоффхайнс А.Дж., Мур К.Л., Лири Дж.А. Определение участков O-сульфатирования тирозина в пептидах и белках. Nat Methods 2007;10:10.
45. Casarosa P, Waldhoer M, LiWang PJ, Vischer HF, Kledal T, Timmerman H, Schwartz TW, Smit MJ, Leurs R.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.

ICVL.RU Портал городского округа Власиха / 2011 — 2022 © www.icvl.ru
При цитировании материалов активная ссылка на www.icvl.ru обязательна