Левомицетин спирт: Левомицетина раствор спиртовой инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание LevomycetIn solution In ethanol р-р д/наружн. прим. (спиртовой) 3%: 25 мл или 40 мл фл. (31127)

сложного эфира мезофильными и термофильными организмами, несущими надежный и эффективный CATec3 Y20F. (A) Биосинтез сконструированного сложного эфира при 37 ° C путем совместного кормления штамма E. coli , экспрессирующего CATec3 Y20F, глюкозой и различными спиртами. (B) Эффективность конверсии спирта. Каждый спирт добавляли в среду из расчета 3 г / л для н-бутанола, изобутанола, н-пентанола и изоамилового спирта, 1 г / л для бензилового спирта и фенилэтилового спирта и 0.3 г / л для гераниола. (C) Преобразование изоамилового спирта в изоамилацетат с подпиткой изоамилового спирта с помощью CATec3 Y20F-экспрессирующей E.coli HSEC01. (D) Биосинтез сложного эфира в развивающихся лепестках розы. Розы (Rosa hybrida) синтезируют летучие эфиры с помощью спиртовых ацилтрансфераз (ААТ), что придает уникальный аромат. (E) Смоделированный эфирный профиль розы по HSEC01. (F) Биосинтез дизайнерского сложного эфира при 55 ° C путем совместного кормления CATec3 Y20F-экспрессирующего ° C.thermocellum штамм HSCT2108 с целлюлозой и различными спиртами. (G) Эффективность конверсии спирта. Каждый спирт добавляли в среду в количестве 3 г / л н-бутанола, 3 г / л изобутанола, 3 г / л н-пентанола, 3 г / л изоамилового спирта и 0,3 г / л гераниола. (H) Производство изобутилового эфира HSCT2108 с различными добавками концентраций изобутанола. На панелях B-C, E и G-H каждое значение представляет собой среднее ± 1 стандартное отклонение для трех биологических повторов.

Естественное воссоздание сложноэфирного профиля роз в

Благодаря высокой эффективности и совместимости сконструированного CAT для биосинтеза дизайнерского сложного эфира в рекомбинантном CATec3 Y20F-экспрессирующем E. coli HSEC01, мы дополнительно исследовали, является ли CATec3 Y20F можно использовать в качестве эффективного ААТ для создания профилей сложных эфиров, проявляемых цветочными растениями. В природе эукариотические ААТ в цветочных растениях образуют смесь летучих сложных эфиров, которые способствуют их полезному взаимодействию с окружающей средой.Например, розы (Rosa hybrida) используют ААТ, регулируемые на стадиях их развития (47), для синтеза и выделения летучих сложных эфиров для привлечения опылителей (рис. 3D). Чтобы имитировать сложноэфирный профиль Rosa hybrida , мы скармливали HSEC01 смесь спиртов с общей рабочей концентрацией 1 г / л, состоящую из 0,2 г / л гексанола, 0,2 г / л 0,15 г / л 3-цис- гексен-1-ол, бензиловый спирт, 0,15 г / л фенилэтилового спирта, 0,1 г / л гераниола, 0,1 г / л нерола и 0,1 г / л цитронеллола в средней логарифмической фазе (OD _{600 нм} ~ 1.0). Рекомбинант E. coli был способен быстро и полностью преобразовывать спиртовую смесь в желаемые профили ацетатного эфира с выходом 97,1 ± 0,7% (моль / моль) и титром ~ 1,5 г / л в течение 12 часов (рис. . 3E, S11A). Для высокого производства сложных эфиров экстракция in situ с использованием наложения гексадекана очень важна для снижения токсичности сложных эфиров (рис. 3E, S11B).

Обеспечение биосинтеза созданного сложного эфира в целлюлолитическом термофиле

Учитывая природную метаболическую способность эффективно разлагать устойчивую целлюлозную биомассу при повышенных температурах (≥ 50 ° C), C.thermocellum , целлюлолитическая, термофильная, облигатно-анаэробная, грамположительная бактерия, превратилась в микробную платформу для консолидированной биопереработки (CBP), где синтез целлюлолитических ферментов, гидролиз биомассы и ферментация могут происходить за один этап для получения желаемых химических веществ. Используя высокую термостабильность CATec3 Y20F, мы исследовали, может ли CATec3 Y20F, содержащий C. thermocellum , катаболизировать целлюлозу и эффективно преобразовывать различные спирты в дизайнерские биоэфиры при повышенной температуре 55 ° C (рис.3F). Мы выбрали сконструированный C. thermocellum Δ clo1313_0613 , Δ clo1313_0693 в качестве хозяина, потому что его две углеводные эстеразы были разрушены, чтобы облегчить деградацию сложного эфира (30). Путем совместного кормления целлюлозой и каждым высшим спиртом рекомбинантный C. thermocellum мог производить все соответствующие эфиры ацетата (фиг. 3G, фиг. S12A). Поскольку C. thermocellum имеет эндогенный путь изобутил-КоА (48), мы также наблюдали образование сложных эфиров изобутирата, таких как бутилизобутират и изобутилизобутират, в качестве побочных продуктов (рис.S12B). Многие из этих сложных эфиров, такие как н-бутиловый, н-пентиловый, изоамиловый и гераниловый сложные эфиры, никогда не сообщалось о возможности синтеза в термофиле. Среди сложных эфиров изоамилацетат был получен с наивысшим выходом конверсии> 30% (моль / моль) и титром 1,2 г / л. Продукция сложного эфира в C. thermocellum была не такой высокой, как наблюдаемая в E. coli , вероятно, из-за метаболической нагрузки, необходимой для выработки целлюлолитических ферментов для разложения целлюлозы вместе со сверхэкспрессией гетерологичного гена.Повышенный титр изобутиловых эфиров был достигнут при кормлении более высокой концентрацией изобутанола (рис. 3H) ниже летальной концентрации (рис. S13), что указывает на то, что экспрессия фермента и / или доступность спирта, вероятно, были ненасыщенными в C. thermocellum . Дальнейшая инженерия штаммов и / или оптимизация среды и рабочих условий могут помочь увеличить производство дизайнерских биоэфиров по технологии CBP.

Термостабильность сконструированного CAT играет решающую роль в эффективном биосинтезе сложных эфиров при повышенных температурах до

Функциональная экспрессия гетерологичного белка в термофилах требует высокой термостабильности, которая не совсем понятна и часто представляет собой значительное узкое место в метаболической инженерии этих организмов. Вдохновленные различиями в каталитической эффективности и температурах плавления между разработанными CAT (Таблица S3), мы исследовали, как термостабильность CATs влияет на выработку сложного эфира в C. thermocellum . Мы охарактеризовали рекомбинантный C.thermocellum Δ clo1313_0613 Δ clo1313_0693 , несущие различные CATs с отличительными температурами плавления и каталитической эффективностью для производства in vivo изобутилового эфира путем совместной подачи целлюлозы и изобутанола при 55 ° C (рис. 4A). Среди рекомбинантных штаммов C. thermocellum HSCT2108, несущий CATec3 Y20F, который имеет наивысшую каталитическую эффективность и температуру плавления, продуцировал самый высокий уровень изобутиловых эфиров (892 мг / л), что примерно в 14 раз выше, чем у CATsa F97W-экспрессирующих. С.термоцелл HSCT2105. Несмотря на то, что CATsa Y20F A138T имеет аналогичную каталитическую эффективность, но более высокую температуру плавления по сравнению с CATsa Y20F, штамм HSCT2113, экспрессирующий CATsa Y20F A138T, продуцировал на 46% больше эфиров, чем штамм HSCT2106, экспрессирующий CATsa Y20F. Точно так же мы также наблюдали более высокую продукцию сложного эфира в штамме HSCT2107, экспрессирующем CATec3, чем в штамме HSCT2105, экспрессирующем CATsa F97W, где CATec3 имеет аналогичную каталитическую эффективность, но более высокую температуру плавления. Примечательно, что и HSCT2107, и HSCT2113 продуцировали сложные эфиры на очень похожем уровне, хотя CATsa Y20F A138T имеет более высокую каталитическую эффективность, но температуру плавления примерно на 10 ° C ниже, чем CATec3.Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что надежность CAT с повышенной термостабильностью играет решающую роль для эффективного производства сложного эфира в ° C. Thermocellum при повышенных температурах.

Влияние термостабильности CAT на устойчивый и эффективный микробный биосинтез сложных эфиров при повышенных температурах. (A) Производство изобутилового эфира рекомбинантных штаммов C. thermocellum , несущих различные CAT. (B-C) Влияние температуры на продукцию изобутилового эфира штаммом (B) CATec3-экспрессирующим HSCT2107 и (C) CATec3-экспрессирующим Y20F штаммом HSCT2108.На панелях A-C , каждые данные представляют собой среднее ± 1 стандартное отклонение для трех биологических повторов. Изобутанол (5 г / л) подавали на ранней стационарной фазе культуры, чтобы избежать ингибирования роста клеток (фиг. S13). (D) Сравнение различий в содержании триптических пептидов CAT между HSCT2108 и HSCT2107 на пептидной основе (n = 6 пептидов). Средняя («x») и медиана («-») log2 различия пептидов составляли 1,1 и 1,0 соответственно. Данные представлены в виде квартилей из трех биологических повторов (значение p <0.005, см. Также рис. S14B).

Для дальнейшего выяснения влияния термостабильности CAT на продукцию сложных эфиров, мы охарактеризовали производительность HSCT2113 и HSCT2108 при различных повышенных температурах (рис. 4B, 4C), совместимых с ростом C. thermocellum . Интересно, что HSCT2113 увеличивал выработку сложного эфира до 220 мг / л при 50 ° C, что примерно в 2 раза выше, чем 55 ° C (фиг. 4B). Напротив, HSCT2108 продуцировал сложные эфиры с относительно аналогичным уровнем около 1 г / л при 50 и 55 ° C, в то время как продукция снижалась до 74 мг / л при 60 ° C (рис.4С). Протеолиз — это распространенный клеточный процесс разрушения и удаления денатурированных или неправильно свернутых белков (49). Если температура роста клеток повлияет на целостность CATs, их внутриклеточная численность изменится. Чтобы исследовать изменения внутриклеточной численности CAT, мы проанализировали и сравнили протеомы двух репрезентативных штаммов, экспрессирующих CATec3, дикого типа (HSCT2107) по сравнению с мутантом Y20F (HSCT2108). Поскольку единственное различие между этими двумя штаммами заключается в замене одной аминокислоты, мы могли надежно количественно оценить относительную численность каждого CAT, сравнивая фрагменты триптических пептидов (рис.S14A). Результат показал, что CATec3 Y20F был в 2,2 раза (средняя разница между содержаниями пептидов) более распространенным, чем CATec3 (фиг. 4D). Поскольку CATec3 Y20F имеет температуру плавления на 7 ° C выше, чем CATec3 (Таблица S3), изменение внутриклеточного содержания белка может означать меньшую степень денатурации или неправильного свертывания из-за более высокой термостабильности белка. В целом термостабильность CAT имеет решающее значение для устойчивого и эффективного производства сложного эфира у термофилов за счет поддержания внутриклеточного обилия белка.

Материалы и методы

Моделирование гомологии белков CATs,

Мы использовали инструменты Swiss-Model (50) и «Builder» коммерческого программного обеспечения MOE (Molecular Operating Environment software). , версия 2019.01) (51) для создания трехмерных (3D) структур CAT, спиртов, ацил-CoAs и их комплексов, как описано ранее (29). Чтобы выполнить моделирование стыковки в MOE, мы начали с поиска потенциального связывающего кармана с помощью инструмента Site Finder и выбора сайта с наилучшей оценкой, который согласуется с указанными каталитическими сайтами (52).Затем мы выполнили моделирование стыковки ацил-КоА и спирта с CAT, используя протокол индуцированной подгонки с методом размещения Triangle Matcher и функцией оценки London ΔG. Мы выбрали позу связывания с наилучшей оценкой, демонстрирующую взаимодействие между остатком и субстратом при среднеквадратичном отклонении (RMSD) <2,3 Å. Мы использовали инструменты MOE «сканирование аланина» и «сканирование остатков» для идентификации потенциальных остатков-кандидатов для мутагенеза комплекса ацил-CoA-спирт-CAT, на основании рассчитанных значений ΔStability и / или ΔAffinity.Кандидаты-мутанты с небольшими значениями ΔStability и / или ΔAffinity выбираются для экспериментального тестирования. Для проведения анализа контакта с белками мы использовали инструмент «Контакты с белками» компании MOE.

Филогенетическое дерево CATs

Множественное выравнивание последовательностей выполняли с использованием MEGA7 (53), как описано ранее (29). Филогенетическое дерево CAT было построено на основе выровненных последовательностей с использованием метода максимального правдоподобия с 1000 повторениями начальной загрузки. Было выбрано ограничение уровня достоверности начальной загрузки 40%.

Молекулярное клонирование и сайт-направленный мутагенез

Праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице S5. Плазмиды конструировали сборкой ДНК Гибсона с использованием продуктов ПЦР, амплифицированных праймерами. Все сконструированные плазмиды были проверены с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования по Сэнгеру. Сайт-направленный мутагенез выполняли с использованием протокола сайт-направленного мутагенеза QuikChange ^™ с использованием ДНК-полимеразы Phusion (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США) и перечисленных праймеров (54, 55).

Характеристика ферментов

Для определения in vitro температур плавления и каталитической эффективности, CAT с меткой His были очищены и охарактеризованы, как описано ранее (29). В анализе 5,5’-дитиобис-2-нитробензойной кислоты (DTNB) конечные концентрации ферментов 0,05-0,1 мкг / мл и 5-10 мкг / мл использовали для реакций с хлорамфениколом и спиртами, соответственно. Для экспериментов по тепловой инактивации 50 мкл очищенных CAT инкубировали при температуре от 50 до 70 ° C в термоциклере в течение часа с температурой крышки 70 ° C.Остаточную активность измеряли при 37 ° C с использованием хлорамфеникола и ацетил-КоА в качестве субстратов и нормализовали по активности образцов, инкубированных при 50 ° C. Для определения кинетики Михаэлиса-Ментен концентрации спиртовых субстратов варьировались следующим образом: (i) 0-400 мМ для этанола, бутанола и изобутанола, (ii) 0-100 мМ для пентанола, изоамилового спирта, 3-цис-гексена. 1-ол, пренол и фурфуриловый спирт, (iii) 0-2 мМ для октанола, (iv) 0-0,2 мМ для деканола, (v) 0-50 мМ для гексанола, цитронеллола, фарнезола и нерола, (vi) 0-40 мМ для 3-метоксибензилового спирта, бензилового спирта и гераниола и (vii) 0-20 мМ 2-фенилэтилового спирта.Для спиртов с низкой растворимостью в реакционный раствор добавляли 10% (мас. / Об.) ДМСО. Ферментные реакции проводили при 50 ° C в считывающем устройстве для микропланшетов BioTek в течение не менее 30 минут с измерениями каждые одну минуту. Кинетические параметры были рассчитаны с использованием метода нелинейной регрессии, как описано ранее (29).

Штаммы и плазмиды

E. coli BL21 (DE3) использовали для экспериментов по экспрессии и очистке белка, а также в экспериментах по конверсии спирта. Плазмиды, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице S6.Для экспериментов C. thermocellum использовали штамм HSCT2005, лишенный Clo1313_0613 и Clo1313_0693 (30).

Среда и культивирование клеток

Штаммы E. coli выращивали в среде лизогенического бульона (LB) или гибридной среде M9, содержащей глюкозу в качестве источника углерода и 5 г / л дрожжевого экстракта с добавлением 100 мкг / мл ампициллина и / или 50 мкг / мл канамицина при необходимости. C. thermocellum штаммов культивировали в анаэробной камере (производство Sheldon, OR, США) с анаэробной газовой смесью (90% N ₂ , 5% CO ₂ , 5% H ₂ ) или резиновой пробкой. запаянные анаэробные пробирки Балча вне камеры.Для трансформации C. thermocellum использовали среду CTFuD или CTFuD-NY (56). Среда CTFuD содержала 2 г / л дрожжевого экстракта, в то время как CTFuD-NY использовала витамины и микроэлементы вместо дрожжевого экстракта. Для поддержания плазмид в C. thermocellum добавляли 10 мкг / мл тиамфеникола. Для экспериментов по конверсии спирта с C. thermocellum штаммы выращивали в определенной среде C-MTC, как описано ранее (30, 57)

C.Клетки thermocellum трансформировали электропорацией, как описано ранее (29, 56). Применяли серию из двух последовательных экспоненциальных импульсов с использованием системы электропорации (каталожный номер 45-0651, BTX Technologies Inc., Массачусетс, США), установленной на 1,8 кВ, 25 мкФ и 350 Ом, что обычно приводило к длительности импульса 7,0 -8,0 мс.

Для приготовления прекультур отдельные колонии из чашек с агаром LB сначала инокулировали в 100 мкл LB в 96-луночных микропланшетах с использованием стерильных наконечников для пипеток.Затем прекультуры выращивали в течение ночи при 37 ° C и 400 об / мин в инкубирующем шейкере для микропланшетов (Fisher Scientific, PA, USA). Затем 5% (об. / Об.) Прекультур инокулировали в 100 мкл гибридной среды M9, содержащей 20 г / л глюкозы, 0,1 мМ IPTG и 2 г / л изобутанола, в 96-луночный микропланшет с гексадекановый слой, содержащий изоамиловый спирт в качестве внутреннего стандарта в соотношении 1: 1 (об. / об.). Микропланшеты закрывали пластиковой клейкой герметизирующей пленкой SealPlate ^® (EXCEL Scientific, Inc., CA, США) и инкубировали при 37 ° C и 400 об / мин в течение 24 ч в инкубирующем шейкере для микропланшетов. Образцы из слоя гексадекана собирали и подвергали ГХ / МС для идентификации сложных эфиров и количественного определения.

Преобразование спиртов в сложные эфиры в

Для периодических культур преобразование спирта в пробирке проводили в 4 мл среды M9, содержащей 10 г / л глюкозы, с добавлением 1 мл гексадекана для экстракции in situ при 37 ° С. Первоначально добавляли 0,1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG), чтобы вызвать экспрессию CATec3 Y20F.В исходную среду добавляли спирты, и выход продукта и титр измеряли через 12, 24 и 48 часов. Для периодических культур с подпиткой, предназначенных для достижения высокого уровня конверсии спиртов (т. Е. Изоамилового спирта, фенилэтилового спирта), клетки выращивали микроаэробно во встряхиваемой колбе с завинчивающейся крышкой объемом 125 мл с рабочим объемом 20 мл среды M9, содержащей 25 г / л глюкозы и 10 мл гексадекана. Объем 25-50 мкл спиртов (чистота ≥98%) добавляли к культуре через 6, 9, 12, 15 и 24 часа с рабочей концентрацией 2 г / л на добавление.

Превращение спиртов в сложные эфиры при температуре

Ферментация целлюлозы в трубочном масштабе была выполнена в периодическом режиме, как описано ранее (29). Вкратце, 19 г / л Avicel PH-101 использовали в качестве единственного источника углерода в объеме культивирования 16 мл. 0,8 мл ночной культуры клеток инокулировали в 15,2 мл среды C-MTC и добавляли 4 мл гексадекана в анаэробную камеру. Каждая пробирка содержала небольшую магнитную мешалку для гомогенизации целлюлозы, и культуру инкубировали в водяной бане, соединенной с регулятором температуры и системой магнитной мешалки.Спирты вводили в культуру через 36 часов, когда клетки вступали в раннюю стационарную фазу роста. pH доводили до 6,4-7,8 с помощью впрыскивания 5 М КОН.

Анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Систему ВЭЖХ (Shimadzu Inc., Мэриленд, США) использовали для количественного определения внеклеточных метаболитов. 800 мкл образцов центрифугировали при 17000 x g в течение 3 минут с последующей фильтрацией через 0,2-микронные фильтры. Образцы были обработаны с 5 мМ H ₂ SO ₄ при 0.6 мл / мин на колонке Aminex HPX-87H (Biorad Inc., Калифорния, США) при 50 ° C. Детектор показателя преломления (RID) и ультрафиолетовый детектор (UVD) при 220 нм использовались для определения концентраций сахаров, органических кислот и спиртов.

Газовая хроматография в сочетании с анализом масс-спектроскопии (ГХ / МС).

ГХ (HP 6890, Agilent, CA, USA), оборудованный МС (HP 5973, Agilent, CA, USA), использовали для количественного определения сложных эфиров. Капиллярная колонка Zebron ZB-5 (Phenomenex, CA, USA) (30 м x 0,25 мм x 0,25 мкм) использовалась с гелием в качестве газа-носителя при скорости потока 0.5 мл / мин. Температурная программа печи была установлена ​​следующим образом: начальная температура 50 ° C, линейное изменение 1 ° C / мин до 58 ° C, увеличение 25 ° C / мин до 235 ° C, увеличение 50 ° C / мин до 300 ° C. , и 2-х минутный отжиг при 300 ° C. В колонку в режиме без разделения вводили 1 мкл образца при температуре инжектора 280 ° C. Для системы МС выбранный ионный режим (SIM) использовался для обнаружения и количественного определения сложных эфиров. В качестве внутреннего стандарта к исходному слою гексадекана добавляли 10 мг / л н-декана и определяли с m / z 85, 99 и 113 в диапазоне времени удерживания от 12 до 15 минут.

Протеомика

Для протеомики культуры клеток отбирали через 48 часов в середине стационарной фазы роста и хранили при -80 ° C перед анализом. Два миллилитра суспензии, содержащей клеток C. thermocellum , растущих на Avicel, осаждали центрифугированием (5000 мкг в течение 10 мин), супернатант удаляли и осадок ресуспендировали в 350 мкл буфера для лизиса (4% SDS, 5 мМ DTT, 100 мМ Трис-HCl, pH 8,0). Клетки лизировали ультразвуком (Branson Sonifier; амплитуда 20%, импульсы 2 с, всего 30 с), предварительно очищали центрифугированием (21000 x g в течение 10 минут) и супернатантом сырого протеина с помощью спектрофотометра Nanodrop OneC (Thermo Scientific).Затем образцы доводили до 15 мМ йодацетамида (20 мин при комнатной температуре в темноте) и 300 мкг очищали с помощью захвата агрегации белка (58). Агрегированный белок (на магнитных шариках Sera-Mag размером 1 микрон; GE Healthcare) затем расщепляли трипсином протеомического класса (1:75 по массе; Promega) в 100 мМ трис-HCl, pH 8,0, в течение ночи при 37 ° C и снова. в течение 3 часов при 37 ° C на следующий день. Высвободившиеся триптические пептиды затем подкисляли до 0,5% муравьиной кислоты, фильтровали через центробежный фильтр MWCO 10 кДа (Vivaspin 2; Sartorius) и количественно определяли с помощью Nanodrop OneC.Затем три микрограмма пептидов анализировали с помощью 1D LC-MS / MS с использованием Vanquish uHPLC, соединенного непосредственно с масс-спектрометром Orbitrap Q Exactive (Thermo Scientific), как описано ранее (59). Пептиды разделяли с помощью 180-минутного органического градиента с использованием вытягиваемого наноразмерного распылителя собственного производства, заполненного 15 см 1,7-микронной обращенно-фазовой смолой Kinetex (Phenomenex). Спектры фрагментации пептидов анализировали / секвенировали с помощью программного обеспечения Proteome Discoverer (Thermo Scientific), а количество пептидов определяли по хроматографической площади под кривой.Содержание пептидов было преобразовано в log2, распределение нормализовано с помощью LOESS и сведено к их соответствующим белкам с помощью RRollup InfernoRDN (60). Затем распределение содержания белка было центрировано по медиане, и статистический анализ был выполнен в Perseus (61). Ручное определение содержания CATec3 в разных штаммах было выполнено путем сравнения тенденций содержания пептида log2 по ортологам, поскольку только одно различие AA различает две формы белка. Все необработанные данные ЖХ-МС / МС были депонированы в репозитории MassIVE и ProteomeXchange со следующими номерами доступа: MSV000086201 (MassIVE) и PXD021695 (ProteomeXchange).Данные могут быть загружены непосредственно через ftp://massive.ucsd.edu/MSV000086201/

Единичная мутация в высококонсервативной области хлорамфениколацетилтрансферазы позволяет Clostridium thermocellum производить изобутилацетат непосредственно из целлюлозы с помощью Clostridium thermocellum при повышенных температурах | Биотехнология для производства биотоплива

Бактериальные штаммы и плазмиды

Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 2. Clostridium thermocellum DSM1313 ∆ hpt (M1354) штамм использовался в качестве хозяина для производства сложного эфира при повышенных температурах. .Следует отметить, что делеция гена гипоксантинфосфорибозилтрансферазы ( hpt, , Clo1313_2927) в DSM1313 дикого типа позволяет проводить генную инженерию путем счетного отбора 8-азагипоксантина (8-AZH); эта делеция не оказывает какого-либо известного вредного воздействия на рост и метаболизм клеток [37, 38]. Плазмида pNW33N, содержащая CAT _Sa , является термостабильной и была использована для экспрессии различных CAT в C. thermocellum . Плазмиды pET использовали для молекулярного клонирования и экспрессии ферментов в E.coli .

Химические вещества и реагенты

Все химические вещества были приобретены у Sigma-Aldrich (Миссури, США) и / или Thermo Fisher Scientific (Массачусетс, США), если не указано иное. Для молекулярного клонирования рестрикционные ферменты и лигаза Т4 были получены от New England Biolabs (Массачусетс, США). ДНК-полимеразу Phusion Hot Start II использовали для полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Среда и культивирование

Для молекулярного клонирования и экспрессии белков E.coli выращивали в лизогенном бульоне (LB), содержащем соответствующие антибиотики, если не указано иное. Для характеристики in vivo CAT _Sa в E. coli использовали гибридную среду M9 [5] с 20 г / л глюкозы. Для культуры C. thermocellum использовали минимальную среду MTC или среду CTFuD-NY [38], как указано в экспериментах. Оптическую плотность (OD) измеряли на спектрофотометре при длине волны 600 нм (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, США).

Анализ множественного выравнивания последовательностей

Анализ множественного выравнивания последовательностей (MSA) выполняли с использованием MEGA7 [39]. Последовательности белков были выровнены с помощью ClustalW [40] и визуализированы с помощью ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr) [41]. Ключевые особенности белковых структур 3U9F [42], 4CLA [43] и 2XAT [44] были извлечены из CAT_SALTI, CAT3_ECOLIX и CAT4_PSEAE, соответственно.

Молекулярное моделирование и имитация стыковки

Трехмерные (3D) структуры

Трехмерная структура CAT _Sa и представляющих интерес спиртов была впервые создана с использованием Swiss-Model [45] и инструментов «Builder» компании MOE (Molecular Программное обеспечение операционной среды, версия 2019.01) соответственно. Трехмерная структура связанного с двойным субстратом комплекса CAT _Sa (т.е. ацетил-CoA-изобутанол-CAT _Sa ) была получена экстракцией изобутанола из комплекса изобутанол-CAT _Sa и последующим добавлением его к ацетилу. -CoA – CAT _Sa комплекс. Все структуры были подготовлены с помощью инструмента «QuickPrep» MOE с параметрами по умолчанию и дополнительно оптимизированы путем минимизации энергии с помощью силового поля Amber10: EHT.

Моделирование стыковки

Для моделирования стыковки был проведен поиск потенциального кармана для привязки с помощью инструмента «Site Finder» Министерства энергетики США.Сайт с наилучшей оценкой, соответствующий заявленным каталитическим сайтам [46], был выбран для дальнейших исследований. Моделирование стыковки выполнялось, как описано ранее [47]. Вкратце, ацетил-КоА и каждый спирт стыковали с использованием протокола индуцированной подгонки с методом размещения Triangle Matcher и оценочной функцией London ΔG . После моделирования стыковки была выбрана поза связывания с наилучшей оценкой, показывающая решающее взаимодействие между остатком и субстратом при среднеквадратичном отклонении (RMSD) <2 Å.В качестве примера для докинга ацетил-КоА была выбрана поза связывания, демонстрирующая водородную связь между гидроксилом Ser-148 и N ⁷¹ КоА [48]. Для стыковки спирта была выбрана поза связывания, показывающая водородную связь между N ³ His-189 и гидроксилом спирта [26].

Анализ мутагенеза in silico

Анализ мутагенеза in silico комплекса ацетил-КоА-изобутанол-CAT _Sa проводили, как описано ранее [47].В частности, инструменты MOE «сканирование аланина» и «сканирование остатков» использовали для идентификации потенциальных остатков-кандидатов для мутагенеза.

Молекулярное клонирование

Конструирование плазмиды

Плазмиды конструировали стандартным методом молекулярного клонирования лигазозависимым методом и / или сборкой Гибсона [49] с использованием праймеров, перечисленных в Дополнительном файле 1: Таблица S1. Сконструированные плазмиды были введены в E.coli TOP10 путем трансформации тепловым шоком.Колонии, выделенные на селективном планшете, подвергали скринингу с помощью ПЦР и очищали плазмиду. Очищенные плазмиды проверяли секвенированием по Сэнгеру перед трансформацией в E. coli BL21 (DE3). Сайт-направленный мутагенез выполняли с использованием протокола сайт-направленного мутагенеза QuickChange ™ с уменьшенной длиной перекрытия [50] или методом сборки Гибсона [49]. Для конструирования C. thermocellum сначала была сконструирована плазмида pHS005, а затем модифицирована до pHS0024. pHS0024 не имеет hpt ниже оперона, тогда как другие последовательности плазмиды идентичны pHS005.

Трансформация

Обычные методы химической трансформации и электропорации были использованы для трансформации E. coli [51] и C. thermocellum [38], соответственно. Однако для C. thermocellum метод был немного изменен, как описано здесь. Сначала C. thermocellum M1354 (таблица 2) культивировали в 50 мл среды CTFuD-NY при 50 ° C внутри анаэробной камеры (Bactron300, Sheldon Manufacturing Inc., OR, США). Культура клеток с OD в диапазоне 0.8–1.0 охлаждали при комнатной температуре в течение 20 мин. За пределами этой точки все шаги выполнялись за пределами камеры. Охлажденные клетки собирали при 6500 × g и 4 ° C в течение 20 мин. Осадки клеток дважды промывали охлажденной льдом водой Milli-Q и ресуспендировали в 200 мкл буфера для трансформации, состоящего из 250 мМ сахарозы и 10% (об. / Об.) Глицерина. Несколько 30 мкл аликвот электрокомпетентных клеток немедленно хранили при -80 ° C для дальнейшего использования. Для электропорации электрокомпетентные клетки размораживали на льду и инкубировали с 500–1000 нг метилированных плазмид [52] в течение 10 мин.Затем клетки переносили в охлаждаемую льдом кювету для электропорации с зазором 1 мм (BTX Harvard Apparatus, Массачусетс, США) с последующими двумя последовательными импульсами экспоненциального затухания с 1,8 кВ, 350 Ом и 25 мкФ. Импульсы обычно давали постоянную времени 7,0–8,0 мс. Клетки немедленно ресуспендировали в предварительно нагретом свежем CTFuD-NY и восстанавливали при 50 ° C в анаэробных условиях (90% N ₂ , 5% H ₂ и 5% CO ₂ ) внутри резинового колпачка Balch. трубка. Через 0–12 ч восстановления клетки смешивали с расплавленной агаровой средой CTFuD-NY с добавлением 15 мкг / мл тиамфеникола.Наконец, смесь клеток среды была вылита в чашку Петри и затвердела внутри анаэробной камеры. Планшет инкубировали при 50 ° C в течение 1 недели до появления колоний. Эффективность трансформации составляла 2–100 колониеобразующих единиц на мкг плазмиды (КОЕ / мкг плазмиды).

Характеристика in vivo CAT

Для характеристики in vivo CAT _Sa и его вариантов в E. coli , культуры с высокой плотностью клеток были выполнены, как описано ранее [53], с добавлением 2 г / л различных спиртов.Для экстракции сложных эфиров in situ каждую пробирку покрывали 25% (об. / Об.) Гексадеканом. Чтобы подтвердить экспрессию белка CAT _Sa и его вариантов, 1% (об. / Об.) Исходных клеток выращивали в течение ночи при 37 ° C и 200 об / мин в 15 мл культуральных пробирках, содержащих 5 мл среды LB и антибиотик. Затем 4% (об. / Об.) Ночных культур переносили в 1 мл среды LB, содержащей антибиотик, в 24-луночный микропланшет. Культуры выращивали при 37 ° C и 350 об / мин, используя шейкер для инкубационных микропланшетов (Fisher Scientific, PA, USA), пока OD не достигала 0.4–0,6, а затем индуцировали 0,1 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) в течение 4 часов с помощью герметичной мембраны Breathe-Easy для предотвращения испарения и перекрестного загрязнения (номер по каталогу 50-550-304, Research Products International Corp. , Иллинойс, США). Образцы белка получали с использованием полного реагента B-PER (каталожный № 89822, Thermo Scientific, Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями производителя и анализировали с помощью SDS-PAGE.

Характеристика фермента

Очистка His-tag

Для экспрессии фермента ночную культуру инокулировали в соотношении 1:50 в свежую среду LB, содержащую 1 мМ IPTG и антибиотик, с последующей инкубацией в течение ночи при 18 ° C (до 20 часов ) во встряхиваемом инкубаторе при 200 об / мин.Индуцированные клетки собирали центрифугированием при 4 ° C и 4700 × g в течение 10 мин. Затем осадок клеток промывали один раз водой Millipore и ресуспендировали в реагенте B-PER Complete. После 30 мин инкубации при комнатной температуре смесь центрифугировали при 17000 × g в течение 2 мин. Супернатант собирали и обозначали как неочищенный экстракт. Для очистки His-tag неочищенный экстракт инкубировали с HisPur Ni – NTA суперпоточной агарозой в партии, как рекомендует производитель.Затем смолу промывали, по крайней мере, тремя объемами промывочного буфера, состоящего из 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 0,1 мМ EDTA. Связанные со смолой белки элюировали 300 мкл элюирующего буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 300 мМ имидазол и 0,1 мМ EDTA. Затем элюированный образец обессоливали и концентрировали через колонку с фильтром Amicon с отсечкой по молекулярной массе 10 кДа. Наконец, образец белка суспендировали в 200 мкл 20 мМ трис-HCl буфера (pH 8.0). Концентрацию белка измеряли методом Брэдфорда [54] с использованием бычьего сывороточного альбумина (БСА) в качестве контрольного белка.

Анализ теплового сдвига

Для измерения температуры плавления белка (Tm) с помощью SYPRO Orange был использован термофлюоресцентный анализ [55]. Около 10–250 мкг очищенного белка His-tag смешивали с 5 × SYPRO Orange в конечном объеме 50 мкл в 96-луночном планшете для кПЦР. Планшет закрывали крышками для ПЦР перед проведением анализа. Аппарат для ПЦР в реальном времени StepOne (Applied Biosystems, Калифорния, США) использовался для запуска анализа со следующими параметрами: репортер ROX, приращение 1 ° C за цикл, выдержка 1 мин в каждом цикле и диапазон температур от 20 до 98 ° С.Данные были собраны, экспортированы и обработаны для расчета Tm.

Анализ 5,5′-дитиобис- (2-нитробензойной кислоты) (DTNB)

Скорость реакции для каждой CAT определяли с помощью анализа DTNB [56] в 384-луночном планшете. Общий реакционный объем составлял 50 мкл с реакционным буфером, содержащим 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0). Концентрации ацетил-КоА (CoALA Biosciences, Техас, США) и спиртов варьировали, как указано в каждом эксперименте. Конечные концентрации фермента 0,05 мкг / мл и 10 мкг / мл использовали для реакций по отношению к хлорамфениколу и спиртам, соответственно.Кинетику реакции собирали путем измерения оптической плотности при 412 нм каждую минуту в течение 1 ч при 50 ° C в считывающем устройстве для микропланшетов (Synergy HTX microplate reader, BioTek). Скорость реакции рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции по стандартной кривой для свободного кофермента А (MP Biomedicals, OH, USA) в тех же условиях. Следует отметить, что, поскольку максимальная рабочая температура, рекомендованная для планшет-ридера, составляет 50 ° C, высокопроизводительный ферментный анализ на CAT при повышенных температурах проводился только для определения параметров кинетики ферментов.

Расчет кинетических параметров для скоростей реакции

Параметры закона скорости Михаэлиса – Ментен (уравнение 1) были рассчитаны для каждого фермента следующим образом. Сначала была проведена линейная регрессия данных, собранных с микропланшетного ридера, чтобы определить начальные скорости реакции, \ (y_ {i} \), при различных начальных концентрациях субстрата, \ (s_ {i} \), где i = {1 , 2,…, n } — количество собранных точек данных. Затем эти начальные скорости реакции и связанные с ними начальные концентрации субстрата для всех повторов были одновременно подогнаны к модели Михаэлиса-Ментен (уравнение.{2}}}} \ right) $$

(2)

$$ \ rho \ left (z \ right) = 2 \ left ({\ sqrt {1 + z}} \ right) — 1. $$

(3)

Задача наименьших квадратов определяет параметры \ (K _ {\ text {M}} \) и \ (v_ {\ text {max}} \) путем минимизации разницы между скоростями реакции, предсказанными моделью \ (v_ {i} \) и измеренные скорости реакции \ (y_ {i} \) (уравнение 2). Функция сглаживания \ (\ rho \ left (z \ right) \) используется, чтобы сделать задачу наименьших квадратов устойчивой к выбросам (уравнение.3). Благодаря непредвзятому сопротивлению выбросам и избежанию ошибок, возникающих при использовании традиционных методов линеаризации, надежная нелинейная регрессия обеспечивает наиболее точную оценку параметров для модели Михаэлиса – Ментен [59].

Производство изобутилацетата в

Ферментация целлобиозы

Получение изобутилацетата из целлобиозы в штаммах C. thermocellum осуществляли с помощью конфигурации двухстадийной биоконверсии.Сначала клетки культивировали в минимальной среде MTC [38], содержащей 5 г / л целлобиозы, в пробирке Балча с резиновым колпачком до достижения OD 0,8–1,0. Клетки охлаждали при комнатной температуре в течение 20 минут и центрифугировали при 4700 × g и 4 ° C в течение 20 минут. После удаления супернатанта клетки ресуспендировали в том же объеме свежей минимальной среды MTC, содержащей 2 г / л изобутанола, в анаэробной камере. Затем клеточную суспензию делили на 800 мкл в микроцентрифужной пробирке на 2,0 мл с завинчивающейся крышкой, покрытой 200 мкл гексадекана.Клетки инкубировали при 55 ° C в течение 24 часов с последующим анализом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометром (ГХ / МС) для количественного определения количества продуцируемого изобутилацетата.

Ферментация целлюлозы

Для ферментации целлюлозы использовали модифицированную среду MTC (среда C-MTC). 20 г / л Avicel PH-101 использовали в качестве единственного источника углерода вместо целлобиозы и добавляли 10 г / л MOPS для увеличения буферной емкости. Начальный pH доводили до 7,5 с помощью 5 М КОН и автоклавировали.В анаэробной камере 0,8 мл ночной культуры клеток инокулировали в 15,2 мл среды C-MTC (соотношение инокуляции 1:20) с 4 мл наложенного гексадекана. Каждая пробирка содержала небольшую магнитную мешалку для гомогенизации целлюлозы. Пробирку Бальча с резиновым колпачком инкубировали в водяной бане, соединенной с регулятором температуры, установленным на 55 ° C, и системой магнитного перемешивания. После корректировки pH с помощью инъекции 70 мкл 5 М КОН, каждые 12 часов отбирали 800 мкл культуры клеток и 200 мкл слоя гексадекана.Во время ферментации pH культуры поддерживался в пределах 6,4–7,8.

Рост клеток контролировали путем измерения белка в осадке. Осадок клетка-целлюлоза из 800 мкл образцов дважды промывали водой Milli-Q и суспендировали в 200 мкл лизирующего буфера (0,2 М NaOH, 1% SDS) с последующей часовой инкубацией при комнатной температуре. Затем раствор нейтрализовали 50 мкл 0,8 М HCl и разбавили 550 мкл воды. Смесь центрифугировали при 17000 × g в течение 3 мин. Концентрацию белка в супернатанте анализировали с помощью совместимого с детергентом анализа Брэдфорда (Thermo Scientific, Вашингтон, США).Остаточный осадок кипятили в печи при 98 ° C в течение часа перед количественным определением остаточной целлюлозы.

Остаточная целлюлоза была определена количественно фенол-сернокислотным методом [60] с некоторыми модификациями. Кипяченный образец дважды промывали водой Milli-Q и суспендировали в 800 мкл воды до объема, эквивалентного исходному. Образец гомогенизировали пипетированием и встряхиванием в течение 10 с, и 20 мкл гомогенизированного образца переносили в новую микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл или 96-луночный планшет и сушили в течение ночи в печи при 55 ° C.Высушенный осадок суспендировали в 200 мкл 95% -ной серной кислоты и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. После полного растворения осадка добавляли 20 мкл 5% фенола и смешивали с раствором серной кислоты. После 30 мин инкубации при комнатной температуре 100 мкл образца переносили в новый 96-луночный планшет и измеряли оптическую плотность при 490 нм. Поглощение переводили в концентрацию целлюлозы по стандартной кривой Avicel PH-101, обработанной той же процедурой.

Аналитические методы

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Количественное определение внеклеточных метаболитов проводили с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Shimadzu Inc., Мэриленд, США). 800 мкл образцов культуры центрифугировали при 17000 × g в течение 3 мин, а затем супернатанты фильтровали через фильтры 0,2 мкм и прогоняли с подвижной фазой 10 мН H ₂ SO ₄ со скоростью 0,6 мл / мин на Aminex HPX. -87H (Biorad Inc., Калифорния, США) при 50 ° C. Детектор показателя преломления (RID) и ультрафиолетовый детектор (UVD) при 220 нм использовались для контроля концентраций сахаров, органических кислот и спиртов.

Газовая хроматография в сочетании с масс-спектроскопией (ГХ / МС)

Сложные эфиры измеряли с помощью ГХ (HP 6890, Agilent, Калифорния, США), снабженной МС (HP 5973, Agilent, CA, США).В системе ГХ для разделения аналитов использовали капиллярную колонку Zebron ZB-5 (Phenomenex, Калифорния, США) (30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм), а в качестве носителя — гелий со скоростью потока 0,5 мл / мин. Температурная программа печи была установлена ​​следующим образом: начальная температура 50 ° C, линейное изменение 1 ° C / мин до 58 ° C, увеличение 25 ° C / мин до 235 ° C, увеличение 50 ° C / мин до 300 ° C. , и 2-х минутный отжиг при 300 ° C. 1 мкл отобранного слоя гексадекана вводили в колонку в режиме без деления с температурой инжектора 280 ° C.Для системы МС выбранный ионный режим (SIM) использовался для обнаружения и количественного определения сложных эфиров со следующими параметрами: (i) этилацетат, m / z 45,00 и 61,00 от 4,2 до 4,6 мин, время удерживания (RT), (ii) изопропилацетат, m / z 45 и 102 от 4,7 до 5,0 мин RT, (iii) пропилацетат, m / z 59 и 73 от 5,2 до 5,8 мин RT, (iv) этил изобутират, m / z 73 и 116 от 6,1 до 6,6 мин RT, (v) изобутилацетат, m / z 61 и 101 из 6.RT от 6 до 7,6 мин, (vi) бутилацетат, m / z 61 и 116 от 7,7 до 9,2 мин RT, (vii) изобутилизобутират, m / z 89 и 129 от 10,1 до 12,5 мин RT, (viii) бензилацетат, m / z , 108 и 150 от 13,1 до 13,8 мин RT, и (ix) 2-фенэтилацетат, m / z , 104 и 121 от 13,8 до 15,5 минут RT . Изоамиловый спирт и изоамилацетат использовали в качестве аналитов внутреннего стандарта. Сложные эфиры идентифицировали RT и количественно определяли по площадям пиков и стандартным кривым.Стандартные кривые были определены с использованием чистых сложных эфиров, разбавленных гексадеканом при концентрациях 0,01 г / л, 0,05 г / л, 0,1 г / л, 0,5 г / л и 1 г / л.

Хлорамфеникол — Онлайн-служба врача

Глазные капли и мазь с хлорамфениколом борются с бактериальными инфекциями глаз. Действующее вещество — антибиотик под названием левомицетин. Этот препарат убивает все виды бактерий, которые могут вызвать глазную инфекцию. В результате симптомы инфекции уменьшаются, а глаз выздоравливает. Вы можете заказать Хлорамфеникол онлайн в аптеках, сотрудничающих с Dokteronline.com.

Что такое хлорамфеникол?

Глазные капли и мазь с хлорамфениколом борются с бактериальными инфекциями глаз. Действующее вещество — антибиотик под названием левомицетин. Этот препарат убивает все виды бактерий, которые могут вызвать глазную инфекцию. В результате симптомы инфекции уменьшаются, а глаз выздоравливает. Вы можете заказать Хлорамфеникол онлайн в аптеках, сотрудничающих с Dokteronline.com.

Для чего используется это лекарство?

Врачи назначают Хлорамфеникол против различных видов глазных инфекций, вызываемых бактериями, таких как конъюнктивит, воспаление роговицы или воспаление век или глазных желез.Симптомы глазной инфекции включают:

• Красный раздраженный глаз;
• Болезненный глаз;
• Плачущий глаз;
• Гной в глазу. Крышки могут слипаться.

Хлорамфеникол быстро уничтожает патогенные бактерии, что позволяет уменьшить симптомы.

Как применять Хлорамфеникол?

Хлорамфеникол выпускается в виде глазных капель и глазных мазей. Перед использованием вымойте руки. Выполняйте дропы следующим образом:

• Наклоните голову назад;
• слегка потяните нижнее веко вниз;
• Нанесите каплю в желоб;
• Закройте глаз и осторожно надавите пальцем на слезный проток в углу глаза в течение двух минут.Это предотвращает слишком быстрое течение офтальмологической жидкости.

Офтальмологическая мазь также наносится, слегка оттягивая нижнее веко вниз. Используйте полоску мази примерно 1 сантиметр, а затем закройте глаз. Вам не нужно прижимать слезный проток. Сразу после этого вымойте руки. После нанесения мази зрение может на время затуманиться. Это пройдет. В листовке содержится дополнительная информация об использовании Хлорамфеникола.

Дозировка

Аптеки-партнеры предлагают Хлорамфеникол онлайн.Если врач не посоветует иное, обычная дозировка следующая: Хлорамфеникол капли:

• Взрослые и дети: каждые два-три часа по 1-2 капли в пораженный глаз.

Мазь с хлорамфениколом:

• Взрослые и дети: три-четыре раза в день наносите мазь мазью 1 см на пораженный глаз.

Продолжайте прием хлорамфеникола до тех пор, пока симптомы не исчезнут через три дня. Не принимайте это лекарство более десяти дней.Если вы не заметили улучшения через три дня, обратитесь к врачу. Перед использованием прочтите инструкцию.

Побочные эффекты

Хлорамфеникол иногда может вызывать побочные эффекты, включая:

• раздражение (покраснение, зуд или жжение) в обработанном глазу;
• помутнение зрения после использования глазной мази.

Если вы страдаете серьезными побочными эффектами или побочными эффектами, не указанными в данном информационном листке, обратитесь к врачу.

Когда лучше не принимать это лекарство?

Хлорамфеникол не всем подходит.Не используйте это лекарство, если вы:

• сверхчувствительны к хлорамфениколу или любому из используемых вспомогательных веществ;
• страдают нарушениями функции печени или кроветворения.

Если вы страдаете какими-либо другими проблемами со здоровьем или принимаете какие-либо другие глазные препараты, укажите это в своем заказе. Врач знает, можно ли безопасно использовать Хлорамфеникол.

Беременность / вождение автомобиля / алкоголь

Используйте это лекарство только после консультации с врачом, если вы беременны или кормите грудью.Офтальмологическая мазь может временно помутнуть ваше зрение. Не участвуйте в трафике, пока не видите резко. Нет никаких предупреждений относительно употребления алкоголя.

Композитные пленки на основе ксантана и поли (винилового спирта) в качестве носителей для иммобилизации хлорамфеникола — DOAJ

Евразийский химико-технологический журнал (Декабрь 2001 г.)

• Алупей Юлиан Корнелиу,
• Попа Марсель,
• Hamcerencu Mihaela,
• Савин Александр,
• Абади Марк Жан

Принадлежности

Алупей Юлиан Корнелиу

“Gr.Медицинский и фармацевтический университет им. Т. Попа, факультет медицинской биоинженерии, ул. 16, 6600 Яссы, Румыния

Попа Марсель

Gh. Asachi »Технический университет, факультет химического машиностроения, Bd. D. Mangeron, nr. 71, 6600 Яссы, Румыния

Hamcerencu Mihaela

Gh.Asachi »Технический университет, факультет химического машиностроения, Bd. D. Mangeron, nr. 71, 6600 Яссы, Румыния

Савин Александр

Gh. Asachi »Технический университет, факультет химического машиностроения, Bd. D. Mangeron, nr. 71, 6600 Яссы, Румыния

Абади Марк Жан

LEMP / MAO, Университет Монпелье II, Place Eugène Bataillon, 34095 Montpellier Cedex 05, France

DOI

https: // doi.org / 10.18321 / ectj566

Том и выпуск журнала

Vol. 3, нет. 3
с. 195 — 200

Аннотация

Читать онлайн

В статье обсуждается метод реализации некоторых систем полимер — лекарство, в которых макромолекулярный носитель представлен трехмерной сеткой на основе ксантана и поливинилового спирта.Зная, что лекарство (хлорамфеникол) должно вводиться посредством процесса диффузии, носитель, выбранный в соответствии с экспериментальной программой, имел самую высокую степень набухания. Несколько вариантов включения левомицетина в синтезированный носитель проанализированы путем изучения кинетики процесса. Исследование высвобождения левомицетина из продуктов включения в виде пленок показало установку кинетики «нулевого порядка». Тесты, посвященные антимикробной активности системы, подтвердили их биологическое действие.

Опубликовано в

ISSN

1562-3920 (Печать)

2522-4867 (онлайн)

Издатель

Казахский национальный университет им. Аль-Фараби

Страна издателя

Казахстан

Субъектов LCC

Наука: химия

Сайт

http: // ect-journal.kz

О журнале

Отображение метабокарты для хлорамфеникола (HMDB0014589)

Путь воздействия:

Биологическое местоположение:

 OC [C @@ H] (NC (= O) C (Cl) Cl) [C @ H] (O) C1 = CC = C (C = C1) [N +] ([ O -]) = O 

 InChI = 1S / C11h22Cl2N2O5 / c12-10 (13) 11 (18) 14-8 (5-16) 9 (17) 6-1-3-7 (4-2-6) 15 (19) 20 / h2-4,8-10,16-17H, 5h3, (H, 14,18) / t8-, 9- / m1 / s1 

1. Wali SS, Macfarlane JT, Weir WR, Cleland PA, Hassan-King M, Whittle HC, Greenwood BM: S однократное инъекционное лечение менингококкового менингита.2. Левомицетин пролонгированного действия. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1979; 73 (6): 698-702. [PubMed: 538813]
2. Бхутта З.А., Ниази С.К., Сурия А: Клиренс хлорамфеникола при брюшном тифе: значение для терапии. Индийский J Pediatr. 1992 март-апрель; 59 (2): 213-9. [PubMed: 1398851]
3. Pecoul B, Varaine F, Keita M, Soga G, Djibo A, Soula G, Abdou A, Etienne J, Rey M: хлорамфеникол длительного действия по сравнению с внутривенным ампициллином для лечения бактериального менингита. Ланцет. 1991, 5 октября; 338 (8771): 862-6.[PubMed: 1681224]
4. Puddicombe JB, Wali SS, Greenwood BM: Полевое испытание однократной внутримышечной инъекции хлорамфеникола длительного действия при лечении менингококкового менингита. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1984; 78 (3): 399-403. [PubMed: 6464136]
5. Натан Н., Борел Т., Джибо А., Эванс Д., Джибо С., Корти Дж. Ф., Гильерм М., Альберти К. П., Пиногес Л., Герен П. Дж., Легрос Д.: короче говоря, цефтриаксон столь же эффективен, как и хлорамфеникол длительного действия. -курсовое лечение менингококкового менингита во время эпидемий: рандомизированное исследование не меньшей эффективности.Ланцет. 2005 г., 23-29 июля; 366 (9482): 308-13. [PubMed: 16039333]

Инженерная неразборчивость хлорамфениколацетилтрансферазы для биосинтеза сложного эфира микробного дизайнера

Публикация

к Хёнмин Со, Чон-Вон Ли, Ричард Дж. Джанноне, Ной Данлэп, Конг Трин

Тип публикации

Журнал

Название журнала

Метаболическая инженерия

Дата публикации

Июль 2021 г.

Номера страниц

179 к 190

Объем

66

Аннотация

Надежные и эффективные ферменты являются важными модулями для метаболической инженерии и стратегий синтетической биологии в биологических системах для создания цельноклеточных биокатализаторов.Конденсируя ацил-КоА и спирт, спиртовые ацилтрансферазы (ААТ) могут служить в качестве взаимозаменяемых метаболических модулей для микробного биосинтеза разнообразного класса молекул сложных эфиров с широким применением в качестве ароматизаторов, ароматизаторов, растворителей и биотоплива. Однако текущая нехватка надежных и эффективных ААТ значительно ограничивает их совместимость с гетерологичными путями-предшественниками и микробными хозяевами. Посредством биоразведки и рациональной инженерии белков мы идентифицировали и сконструировали беспорядочную связь хлорамфениколацетилтрансфераз (CAT) от мезофильных прокариот, чтобы они функционировали как надежные и эффективные ААТ, совместимые как минимум с 21 спиртом и 8 ацил-КоА субстратом для микробного биосинтеза линейных, разветвленных, насыщенные, ненасыщенные и / или ароматические сложные эфиры.Подключив лучший сконструированный CAT (CATec3 Y20F) к грамотрицательной мезофильной бактерии Escherichia coli, мы продемонстрировали, что рекомбинантный штамм может эффективно превращать различные спирты в желаемые сложные эфиры, например, достигая титра 13,9 г / л изоамилацетата. с конверсией 95% при периодической ферментации с подпиткой. Рекомбинантная кишечная палочка также была способна моделировать сложноэфирный профиль роз с высокой конверсией (> 97%) и титром (> 1 г / л) ферментируемых сахаров при 37 ° C. Точно так же рекомбинантная грамположительная целлюлолитическая термофильная бактерия Clostridium ther-mocellum, несущая CATec3 Y20F, может производить многие из этих сложных эфиров из устойчивой целлюлозной биомассы при повышенных температурах (> 50 ° C) благодаря замечательной термостабильности сконструированного фермента.В целом, сконструированные CAT могут служить надежной и эффективной платформой для биосинтеза сложных эфиров из возобновляемых и устойчивых источников сырья.

Новые бифункциональные органокатализаторы на основе хлорамфеникола, функционализированные амидами, для энантиоселективного алкоголиза мезоциклических ангидридов

Серия новых бифункциональных катализаторов на основе амида хлорамфеникола 7a — q (схема 1) была синтезирована из соответствующего оптически чистого (1 R , 2 R ) -диамина 6 , полученного в несколько стадий. из основы левомицетина [50].В общем, синтез прост и хорошо совместим с электронно-диверсифицированными амидами. В частности, лучше работали электронодефицитные амиды. С 3,5- (CF ₃ ) ₂ -дизамещенным амидом соответствующий продукт 7i был получен с выходом 90%. Различные защитные группы для азота в положении C-2 и кислорода в положении C-3 также исследуются для получения желаемых хиральных катализаторов с использованием простой процедуры.

Схема 1: Синтез бифункциональных амидных катализаторов 7a – q .

Схема 1: Синтез бифункциональных амидных катализаторов 7a – q .

При наличии различных бифункциональных катализаторов оценку их каталитического поведения при энантиоселективном алкоголизе мезо -циклического ангидрида 8a проводили в различных условиях с 10 эквивалентами метанола.В результате, эти новые кислотно-основные катализаторы Бренстеда 7a — q оказались достаточно активными и дали моноэфирный продукт с высоким выходом и превосходной энантиоселективностью, что свидетельствует об уникальной реакционной способности этого хлорамфениколового каркаса на основе амида.

Впервые исследованы электронные эффекты. Как правило, электронодефицитные катализаторы дают лучшую реакционную способность и энантиоселективность, чем богатые электронами варианты (таблица 1, записи 1–9).Среди них 7i показал наилучшие результаты с 95% выходом и 92% ее за 17 часов (таблица 1, запись 9). Неожиданная реакционная способность с этим бедным электронами 7i предполагает, что p K a является решающим для этого катализа. Дальнейшие модификации скелета хлорамфеникола с различными защитными группами на азоте в положении C-2 и кислороде в положении C-3 не улучшали реакцию, но приводили к снижению энантиоселективности (таблица 1, позиции 10–16). Примечательно, что с метил-защищенным катализатором 7q эта реакция протекала с более длительным временем реакции, но со сниженной энантиоселективностью, что свидетельствует о влиянии объемной эфирной группы (таблица 1, запись 17).Затем оценивали действие растворителя, и апротонные растворители работали лучше, чем протонные растворители (таблица 1, позиции 18 и 19), что соответствует литературным данным [45]. Кроме того, изменение концентрации или понижение температуры реакции не повлияло на выход или энантиоселективность, что предполагает независимость этой каталитической системы от концентрации / температуры (таблица 1, записи 20–23). Эти результаты подразумевают, что в этой системе нет значительной агрегации катализаторов.

Таблица 1: Скрининг условий асимметричного метанолиза мезо -циклических ангидридов.

^a Изолированный выход. ^b Определено с помощью ВЭЖХ после превращения в производные амида с помощью ( S ) -1-фенилэтиламина. ^c Абсолютная конфигурация была определена путем сравнения с литературными данными.

Этот бифункциональный кислотно-основной катализатор Бренстеда 7i оказался высокоактивным в отношении асимметричного метанолиза различных мезо -циклических ангидридов. Как показано в таблице 2, различные циклические ангидриды легко превращали в соответствующие моноэфирные продукты с высокими выходами и энантиоселективностью.Примечательно, что бициклические ангидриды (таблица 2, элементы 1 и 2) и трициклические ангидриды (таблица 2, элементы 3 и 4) были более реакционноспособными, чем моноциклические ангидриды (таблица 2, элементы 5–12). В случае монозамещенных циклических субстратов, включая алкил- (таблица 2, элементы 5–7), простой эфир (элемент 8), арильное замещение (элементы 9–11), были обнаружены умеренные энантиоселективности. Более того, хиральные монозамещенные продукты являются универсальными ключевыми строительными блоками для синтеза различных промышленно важных фармацевтических препаратов, таких как γ-аминомасляная кислота (ГАМК) и аналоги γ-амино-β-гидроксимасляной кислоты (ГАБОБ) (баклофен HCl). и прегабалин) [51-54], ингибиторы HMG-CoA редуктазы («статины») [55-57] и т. д.

Таблица 2: Асимметричный метанолиз мезо -циклических ангидридов. ^{а, б} .

^a Если не указано иное, реакции проводили с ангидридом (0.5 ммоль), MeOH (5,0 ммоль) и 7i (10 мол.%) В МТБЭ (10 мл) при комнатной температуре. ^b Абсолютная конфигурация была определена путем сравнения с литературными данными. ^c Изолированный выход. ^d Определено с помощью ВЭЖХ после дериватизации. ^e В МТБЭ (40 мл) при 0 ° C.

Общность и масштаб этой методологии были дополнительно продемонстрированы при алкоголизе 8a с различными спиртами (Таблица 3).Во всех случаях были получены отличные выходы с высокой энантиоселективностью. В этой реакции хорошо проявил себя стерически более объемный 2-пропанол. Аллиловый спирт, бензиловый спирт и циннамиловый спирт также хорошо совместимы в условиях бифункционального органокатализа для получения желаемых продуктов.

Таблица 3: Асимметричный алкоголиз ангидрида 8a различными спиртами. ^a

^a Если не указано иное, вышеуказанные реакции проводили с ангидридом (0.5 ммоль), MeOH (5,0 ммоль) и катализатор 7i (10 мол.%) В МТБЭ (40 мл) при комнатной температуре. ^b Изолированный урожай. ^c Определено с помощью ВЭЖХ после дериватизации. ^d Абсолютная конфигурация была определена путем сравнения с литературными данными.

Применение этой методологии к синтезу ( S ) -ГАБОБ ( 13 ), метаболического производного нейромедиатора γ-аминобутановой кислоты, было выполнено, чтобы проиллюстрировать синтетическую полезность [58,59] (Схема 2).Из коммерчески доступного диэтил-3-гидроксиглутарата ( 10 ) в три стадии получали ангидрид 8h с общим выходом 54%. Ключевой амид основания хлорамфеникола 7i , катализируемый энантиоселективным алкоголизом, давал моноэфир 9h в масштабе нескольких граммов. Полученный моноэфир с желаемым стереоцентром при С-3 превращали в тризащищенное производное GABOB 11 посредством перегруппировки Курциуса с выходом 75% за две стадии. После катализируемого Pd / C гидрогенизирующего снятия защиты гидроксигруппы в метаноле в кислых условиях соответствующий спирт 12 был перенесен в продукт 13 посредством кислотного снятия защиты.Однократная перекристаллизация из этанола позволила выделить 13 с ее выходом 96% и выходом 73%.

Схема 2: Асимметричный синтез ( S ) -ГАБОБ ( 13 ).

Схема 2: Асимметричный синтез ( S ) -ГАБОБ ( 13 ).