Человеческая кожа: Кожа: многофункциональный орган с требованиями

Кожа человека , в анатомии человека, покрытие или покров поверхности тела, которая обеспечивает защиту и получает сенсорные стимулы от внешней среды.Кожа состоит из трех слоев ткани: эпидермиса, самого внешнего слоя, который содержит первичную защитную структуру, роговой слой; дерма — волокнистый слой, поддерживающий и укрепляющий эпидермис; и подкожный слой, подкожный слой жира под дермой, который снабжает питательными веществами два других слоя и который смягчает и изолирует тело.

Отличительные особенности

Узнайте, как регенеративные свойства кожи помогают защитить человеческое тело от внешней среды.

Кожа человека, клетки которой непрерывно генерируются организмом, служит защитным барьером между внутренней частью человеческого тела и окружающей средой.

Очевидное отсутствие волос на теле сразу отличает человека от всех других крупных наземных млекопитающих. Независимо от индивидуальных или расовых различий, человеческое тело кажется более или менее безволосым в том смысле, что волосы настолько рудиментарны, что кажутся отсутствующими; тем не менее, в некоторых областях волосы растут обильно. Эти относительно волосатые места могут быть названы эпигамными областями, и они связаны с социальным и сексуальным общением, либо визуально, либо по запаху желез, связанных с волосяными фолликулами.

Британская викторина

Человеческие органы: факт или вымысел?

Это правда, что мы используем только десять процентов нашего мозга? Сетчатка — это хрусталик в передней части глаза? Разбери эти вопросы и узнай больше о человеческих органах.

Характерные черты кожи меняются от рождения до старости.У младенцев и детей он бархатистый, сухой, мягкий, без морщин и пятен. Дети младше двух лет потеют плохо и нерегулярно; их сальные железы функционируют минимально. В подростковом возрасте волосы становятся длиннее, толще и пигментированнее, особенно на коже черепа, подмышечных впадинах, на лобке и на мужском лице. Увеличивается общая пигментация кожи, загадочным образом появляются локализованные пигментные очаги, часто развиваются угри. Рост волос, потоотделение и секреция сальных желез начинают расцветать.С возрастом анатомические и физиологические изменения, а также воздействие солнечного света и ветра делают кожу, особенно не защищенную одеждой, сухой, морщинистой и дряблой.

Кожа человека больше, чем у любого другого млекопитающего, демонстрирует поразительные топографические различия. Примером может служить различие между ладонями и тыльной стороной ладоней и пальцев. Кожа бровей толстая, грубая и волосатая; что на веках тонкие, гладкие и покрыты почти невидимыми волосками.Лицо редко бывает заметно волосатым на лбу и скулах. Он полностью лишен волос на ярко-красной кайме губ, но у самцов сильно опушен на подбородке и челюстях. Поверхности лба, щек и носа обычно жирные, в отличие от относительно нежирной нижней поверхности подбородка и челюстей. Кожа груди, лобковой области, волосистой части головы, подмышек, живота, подошв ступней и кончиков пальцев различается структурно и функционально так же, как если бы кожа в этих различных областях принадлежала разным животным.

Обшивка приобретает прочность и гибкость благодаря тому, что она состоит из ряда слоев, ориентированных таким образом, что каждый структурно и функционально дополняет другие. Чтобы обеспечить связь с окружающей средой, бесчисленные нервы — некоторые из которых модифицированы как специализированные конечные рецепторные органы, а другие — более или менее бесструктурные — подходят как можно ближе к поверхностному слою, и почти каждый орган кожи окружен клубками тонких сенсорных нервов.

Дерма составляет основную часть кожи и обеспечивает физическую защиту. Он состоит из ассоциации волокон, в основном коллагена, с материалами, известными как гликозаминогликаны, которые способны удерживать большое количество воды, тем самым сохраняя упругость кожи. Сеть растяжимых эластичных волокон сохраняет кожу упругой и восстанавливает ее после растяжения.

Волосяные фолликулы и кожные железы происходят из эпидермиса, но глубоко внедрены в дерму.Дерма обильно снабжена кровеносными сосудами, но ни один из них не проникает в живой эпидермис. Эпидермис получает материалы только путем диффузии снизу. Дерма также содержит нервы и органы чувств на разных уровнях.

Кровеносные и лимфатические сосуды

Кожа человека чрезвычайно хорошо снабжена кровеносными сосудами; он пронизан запутанной, хотя и явно упорядоченной массой артерий, вен и капилляров. Такой приток крови, намного превышающий максимальные биологические потребности самой кожи, свидетельствует о том, что кожа обслуживает кровеносную систему, действуя как охлаждающее устройство.Чтобы помочь в этой функции, потовые железы выливают на его поверхность воду, испарение которой поглощает тепло кожи. Если окружающая среда холодная и необходимо сохранять тепло тела, кожные кровеносные сосуды сокращаются в быстрых, последовательных ритмах, позволяя только небольшому количеству крови проходить через них. Когда окружающая среда теплая, они сокращаются через длительные промежутки времени, обеспечивая свободный кровоток. Во время мышечной нагрузки, когда необходимо отвести большое количество выделяемого тепла, кровоток через кожу максимален.

Кожа не только контролирует температуру тела, но и регулирует кровяное давление. Большую часть кровотока можно контролировать, открывая и закрывая определенные сфинктероподобные сосуды в коже. Эти сосуды позволяют крови циркулировать через периферические капиллярные русла или обходить их, шунтируясь непосредственно из мелких артерий в вены.

Кожа человека пронизана сложной сеткой лимфатических сосудов. В более поверхностных частях дермы крошечные лимфатические сосуды, которые, кажется, заканчиваются слепыми мешочками, функционируют как притоки поверхностной лимфатической сети, которая, в свою очередь, открывается в сосуды, которые постепенно становятся больше в более глубоких частях дермы.Более глубокие и крупные сосуды заключены в рыхлой соединительной ткани, окружающей вены. Стенки лимфатических сосудов настолько дряблые и разрушенные, что часто ускользают от внимания в образцах, подготовленных для микроскопических исследований. Однако их обилие было продемонстрировано путем введения жизненно важных красителей внутрь дермы и наблюдения за очищением от красителя.

Поскольку лимфатические сосуды имеют минимальную мускулатуру или ее стенки отсутствуют, циркуляция лимфы вялая и в значительной степени контролируется такими внешними силами, как давление, действие скелетных мышц, массаж и тепло.Любое внешнее давление, например, даже от неподвижной повязки, препятствует ее течению. Поскольку кожа играет важную роль в иммунологических реакциях организма, ее лимфатический дренаж так же важен, как и его кровеносная сосудистая система.

Поверхность кожи

Неповрежденная поверхность кожи изрезана отверстиями потовых желез и волосяных фолликулов — так называемыми порами — и изрезана пересекающимися линиями, очерчивающими характерные узоры. У всех людей есть примерно одинаковые отметины на любой части тела, но детали уникальны.Линии ориентированы в общем направлении упругого натяжения. Бесчисленное количество их глубоких и мелких, вместе с порами, придают каждой области тела характерную топографию. Как и более глубокие борозды и гребни на ладонях и подошвах, морщины на коже в основном формируются еще до рождения. Мелкие детали каждого участка поверхности тела индивидуальны. Отпечатки пальцев используются как средство идентификации личности, поскольку они имеют высокий рельеф, более четкие узоры и могут быть легко получены.

Некоторые морщинки на поверхности кожи появляются после рождения в результате использования или повреждения. Например, борозды на лбу — это акцент на ранее существовавших врожденных линиях, которые становятся сильно подчеркнутыми в пожилом возрасте. Поскольку с возрастом кожа становится менее упругой, на ней также образуются морщины. Некоторые профессии оставляют на коже следы, которые, в зависимости от продолжительности и степени тяжести, могут быть временными или постоянными.

Ладони рук и подошвы ступней покрыты отчетливыми чередующимися гребнями и бороздками, которые вместе составляют дерматоглифы.Гряды следуют переменным курсом, но их расположение в определенных областях имеет согласованный структурный план. Хотя гребни кажутся непрерывными, они имеют множество разрывов и неровностей, разветвляются и различаются по длине. На каждом небольшом участке поверхности есть детали гребня, которые не совпадают ни у одного человека, ни у другого человека, даже у идентичного близнеца. Эта безошибочная подпись делает дерматоглифы самым известным физическим признаком для идентификации личности.

Кожа: самый большой орган человеческого тела

Кожа — это больше, чем просто мясистая поверхность для прыщей, татуировок и морщин.Согласно данным Университета штата Орегон, кожа является самым большим органом тела, а вместе с волосами, ногтями, железами и нервами является частью покровной системы. Эта система действует как защитный барьер между внешней и внутренней частью тела.

У взрослых кожа составляет около 16 процентов от общей массы тела и занимает площадь около 22 квадратных футов (2 квадратных метра ).

На разных участках тела кожа бывает разной толщины и текстуры.Например, согласно данным Библиотеки здоровья Джонса Хопкинса, кожа под глазами тонкая как бумага, но толстая на подошвах ног и ладонях.

Три слоя ткани

Согласно данным клиники Кливленда, кожа человека состоит из трех слоев ткани: эпидермиса, дермы и гиподермы.

Эпидермис

Эпидермис — это верхний видимый слой кожи, который постоянно обновляется, поскольку омертвевшие клетки кожи ежедневно удаляются.Основные функции эпидермиса:

• Создание новых клеток кожи . Внизу эпидермиса образуются новые клетки кожи. По мере формирования этих новых клеток им требуется около месяца, чтобы достичь верхнего слоя эпидермиса. Новые клетки заменят старые клетки на поверхности кожи, которые отмерли и постоянно отслаиваются.
• Придает коже цвет . Эпидермис содержит меланоциты — клетки, вырабатывающие меланин — пигмент, придающий коже ее цвет.Меланин также отвечает за загар и веснушки.
• Защитная кожа . Кератин, белок, вырабатываемый клетками эпидермиса, придает коже прочность и прочность и защищает ее от высыхания.

Дерма

Дерма — это средний слой кожи, расположенный под эпидермисом. Это самый толстый слой кожи, содержащий нервы и кровеносные сосуды. Здесь также находятся потовые железы, сальные железы и волосяные фолликулы. Согласно Медицинской библиотеке Джонса Хопкинса, дерма придает коже гибкость и прочность.Он состоит в основном из белка коллагена, который делает кожу эластичной и крепкой.

По данным Национальной медицинской библиотеки, дерма выполняет следующие функции:

• Ощущение боли и прикосновения . Нервные окончания дермы содержат рецепторы, передающие в мозг такие ощущения, как боль, давление, прикосновение, зуд и температура.
• Производство пота и масел . Потовые железы помогают охладить тело, а сальные железы вырабатывают масла, которые сохраняют кожу мягкой и влажной.
• Рост волос . Волосяные фолликулы, обнаруженные в дерме, вырастают волосы на голове, лице и теле. Эти волосы также помогают контролировать температуру тела и защищать тело от травм.
• Доведение крови до кожи . Кровеносные сосуды в дерме питают кожу и помогают контролировать температуру тела. Когда кожа становится слишком горячей, кровеносные сосуды расширяются, выделяя тепло с поверхности кожи, в то время как холод сужает кровеносные сосуды, сохраняя тепло тела.
• Борьба с инфекцией .Лимфатические сосуды, которые отводят жидкость из тканей и являются важной частью иммунной системы, расположены в дерме. Они помогают предотвратить инфекции и другие вредные вещества.

Гиподерма

Гиподерма, также называемая подкожно-жировой клетчаткой, является самым глубоким слоем кожи. Этот слой состоит в основном из жировой ткани, которая помогает защитить тело от жары и холода. Гиподерма также служит хранилищем энергии для жира. Согласно Библиотеке здоровья Джонса Хопкинса, этот жир обеспечивает мягкую подкладку для внутренних органов, а также мышц и костей и защищает тело от травм.

Общие кожные заболевания

Дерматологи — это врачи, специализирующиеся на лечении заболеваний, нарушений и травм кожи, волос и ногтей. Они лечат общие заболевания, такие как прыщи и бородавки; хронические кожные заболевания, такие как экзема и псориаз; и более серьезные заболевания, такие как рак кожи, по данным Американской академии дерматологии (AAD).

Бородавки и родинки

Бородавки — это доброкачественные (доброкачественные) образования на коже, вызванные вирусом папилломы человека (ВПЧ), согласно AAD.Они часто возникают на руках и подошвах. Иногда на бородавке видны крошечные черные точки.

«Это закупоренные кровеносные сосуды, которые являются обычным явлением при вирусной инфекции папилломы», — сказал доктор Чарльз Е. Кратчфилд, клинический профессор дерматологии в Медицинской школе Университета Миннесоты и медицинский директор дерматологии Кратчфилда.

Лучшее лечение бородавок — вызвать легкое раздражение этих кожных новообразований — обычно путем их замораживания, применения химического вещества, такого как салициловая кислота, или использования лазеров, — чтобы иммунная система могла распознать вирусную инфекцию и избавиться от нее.

Родинки — это еще один тип распространенного образования на коже. Чаще всего они коричневые или черные, но некоторые могут быть красными или телесного цвета, а также могут казаться плоскими или приподнятыми. По словам Кратчфилда, если родинка начинает меняться в размере, цвете или форме, или если она кровоточит и не заживает сама по себе в течение трех недель, ее следует обследовать, чтобы убедиться, что она не перерастает в рак кожи.

Угри и экзема

Угри, заболевание волос и сальных желез, являются одними из наиболее распространенных кожных заболеваний, которые лечат дерматологи, сообщил Кратчфилд Live Science.

По данным клиники Майо, прыщи возникают, когда волосяные фолликулы закупориваются жиром и омертвевшими клетками кожи. По словам Кратчфилда, состояние проявляется в виде красных шишек и прыщей на лице, груди и спине. Для лечения прыщей используются продукты с витамином А (ретинолы предотвращают закупорку волосяных фолликулов), салициловую кислоту (для закрытия пор), пероксид бензоила (для уменьшения количества бактерий) и антибиотики (для уменьшения воспаления).

Экзема выглядит как пятна красной, зудящей, неровной кожи, и наиболее распространенный тип известен как атопический дерматит.Состояние может возникать на любом участке кожи. Иногда он вспыхивает сам по себе, а в других случаях это вызвано определенным триггером, например раздражителем кожи, таким как ядовитый плющ , или воздействием аллергена, согласно Кратчфилду.

Экзему лучше всего лечить с помощью местных противовоспалительных кремов и мазей, которые уменьшают зуд и покраснение. При легких симптомах хорошо работают лекарства, отпускаемые без рецепта, но в более тяжелых случаях может потребоваться рецептурный кортизон.

Рак кожи

Рак кожи — это аномальный рост клеток кожи, наиболее распространенным типом которого является базальноклеточная карцинома, сказал Кратчфилд. По данным Фонда рака кожи, в США ежегодно диагностируется более 4 миллионов случаев базальноклеточного рака. По данным клиники Майо, этот тип рака имеет цвет кожи, розовый или слегка жемчужно-белый цвет и обычно появляется на открытых солнцу участках лица, ушей или шеи. Кратчфилд предупредил, что он редко распространяется на другие части тела, но может быть очень проблематичным, если его не лечить.

Второй по распространенности тип рака кожи — плоскоклеточный рак. По данным AAD, это может выглядеть как розовая или белая шишка, грубое чешуйчатое пятно или язва, которая не заживает.

Самым серьезным раком кожи является меланома, которая выглядит как темное, меняющееся, кровоточащее пятно на коже, сказал Кратчфилд. Этот рак начинается в клетках кожи, вырабатывающих пигмент, и, хотя это самая редкая форма рака кожи, он вызывает большинство смертей от рака кожи.

Дополнительные ресурсы:

Эта статья была обновлена ​​окт.22 августа 2018 г., автор Live Science Contributor, Кари Ниренберг.

Кожа: объяснение структуры и функций

Кожа, занимающая в среднем 20 квадратных футов, является самым большим и тяжелым органом тела. Его наиболее очевидная задача — защищать внутреннюю часть тела от окружающей среды, но кожа — это гораздо больше, чем это.

Помимо своей роли защитного барьера, кожа помогает людям поддерживать нужную внутреннюю температуру и позволяет им ощущать мир через нервные окончания.

Кожа — сложный орган. В среднем квадратный дюйм кожи содержит 650 потовых желез, 20 кровеносных сосудов и более 1000 нервных окончаний. Несмотря на толщину всего в несколько миллиметров, кожа составляет около одной седьмой массы тела человека.

В этой статье мы рассмотрим основы скина, как он устроен, что он делает и как это делается.

Кожа состоит из трех основных слоев — эпидермиса, дермы и гиподермы.

Эпидермис

Эпидермис — это самый внешний слой.Это водостойкий барьер, придающий коже оттенок. Его основные роли:

• для создания новых клеток кожи
• для придания коже ее цвета
• для защиты тела от внешней среды

Люди теряют около 500 миллионов клеток кожи каждый день. Фактически, самые внешние части эпидермиса состоят из 20–30 слоев мертвых клеток.

Эпидермис постоянно производит новые клетки в нижних слоях. В течение примерно четырех недель эти клетки выходят на поверхность, становятся твердыми и заменяют отшелушивающие мертвые клетки.

Кератиноциты — наиболее распространенный тип клеток эпидермиса. Их работа — действовать как барьер против бактерий, паразитов, грибков, вирусов, тепла, ультрафиолетовых (УФ) лучей и потери воды.

Эпидермис не содержит кровеносных сосудов. Цвет кожи зависит от пигмента под названием меланин, который вырабатывается меланоцитами. Они находятся в эпидермисе и защищают кожу от УФ-лучей.

Пять слоев эпидермиса:

• stratum corneum
• stratum lucidum
• stratum granulosum
• stratum spinosum
• stratum germinativum

Тонкий слой волокон, известный как базальная мембрана, разделяет эпидермис .

Дерма

Дерма служит соединительной тканью и защищает организм от стресса и напряжения. Это также придает коже прочность и эластичность. Кроме того, его основные роли:

• для производства пота и масла
• для обеспечения чувствительности и кровоснабжения кожи
• для роста волос

Причина, по которой дерма может выполнять эти функции, заключается в том, что в ней находятся волосяные фолликулы, кровеносные сосуды и лимфатические сосуды. Он является домом для ряда желез, в том числе потовых и сальных желез, которые вырабатывают кожный жир — масло, которое смазывает и делает волосы водонепроницаемыми.

Дерма также содержит рецепторы, определяющие давление (механорецепторы), боль (ноцицепторы) и тепло (терморецепторы).

Если дерма сильно растягивается, например, во время беременности, она может порваться. Позже это проявится в виде растяжек.

Дерма далее разделяется на два слоя:

Папиллярная область

Папиллярная область содержит рыхлую соединительную ткань. Он имеет выступы в виде пальцев, которые вдавливаются в эпидермис. Эти выступы придают дерме неровную поверхность и отвечают за рисунок кончиков пальцев человека.

Ретикулярная область

Ретикулярная область содержит плотную, неправильно организованную соединительную ткань. Белковые волокна в ретикулярной области придают коже прочность и эластичность.

Подкожная ткань

Самый глубокий слой кожи — это подкожная клетчатка, гиподерма или подкожный слой. Технически это не часть кожи, но помогает прикрепить кожу к костям и мышцам. Подкожная ткань также обеспечивает кожу нервами и кровоснабжением.

Гиподерма в основном состоит из жира, соединительной ткани и эластина, который представляет собой эластичный белок, который помогает тканям возвращаться к своей нормальной форме после растяжения. Высокий уровень жира помогает изолировать тело и не дает человеку терять слишком много тепла. Жировой слой также действует как защита, укрепляя кости и мышцы.

Некоторые из многих функций кожи включают:

• Защита от патогенов. Клетки Лангерганса кожи являются частью иммунной системы.
• Хранение липидов (жиров) и воды.
• Создание ощущений с помощью нервных окончаний, которые определяют температуру, давление, вибрацию, прикосновение и травму.
• Контроль потери воды путем предотвращения утечки воды при испарении.
• Обеспечивает водонепроницаемость за счет предотвращения вымывания питательных веществ с кожи.
• Помогает с терморегуляцией за счет потоотделения и расширения кровеносных сосудов, что помогает сохранять тело прохладным. «Мурашки» и сужение кровеносных сосудов помогают людям сохранять тепло.

Цвет кожи — это фенотип, который является наблюдаемой чертой, такой как цвет глаз или рост. Цвет получается из-за различных типов пигмента, называемого меланином.

Основная роль меланина заключается в защите кожи от вредного солнечного УФ-излучения, которое может вызвать рак кожи. Когда кожа подвергается воздействию ультрафиолета, меланоциты начинают вырабатывать меланин, создавая загар.

У людей с повышенным содержанием феомеланина кожа будет бледнее. У людей, у которых больше эумеланина, будет более темная кожа.Исследования эволюции показывают, что исторически люди, расположенные ближе к экватору, имели более темную кожу для лучшей защиты от солнечных лучей. С другой стороны, люди в более холодном климате развили более светлую кожу, чтобы лучше поддерживать витамин D.

В целом, у женщин кожа светлее, чем у мужчин. Это может быть связано с тем, что женщинам нужно больше кальция во время беременности и кормления грудью. Витамин D вырабатывается, когда кожа подвергается воздействию солнца, и он важен для усвоения кальция.

Кожа, как и любой другой орган тела, подвержена определенным заболеваниям.К ним относятся:

• Атопический дерматит: Это воспалительное заболевание кожи, также известное как экзема, характеризуется появлением сухих, красных и зудящих участков кожи.
• Угри: Это, пожалуй, самое распространенное кожное заболевание. Это происходит, когда волосяные фолликулы забиваются омертвевшими клетками кожи и маслом.
• Меланома: Тип рака кожи, вызванный чрезмерным воздействием солнечного света.
• Розацеа: Распространенная сыпь у людей среднего возраста.У них есть склонность к покраснению и небольшие красные бугорки в центре лица.
• Псориаз: Это аутовоспалительное заболевание кожи. Это вызывает появление красных шелушащихся пятен на коже.
• Чесотка: Зуд кожи, вызванный чесоточным клещом человека.
• Опоясывающий лишай: Также называемый опоясывающим герпесом, это болезненная волдыря, вызванная вирусом.
• Красный плоский лишай: Зудящая сыпь неинфекционного происхождения. Шишки имеют плоские блестящие вершины.

С возрастом кожа человека меняется. Он становится тоньше и его легче повредить. Эпидермис замедляется при замене омертвевших клеток кожи и замедляется процесс заживления. В целом у человека будет меньше кожи и она станет менее эластичной.

Пожилые люди могут обнаружить, что их кожа становится более сухой, раздраженной и тонкой. Кожа может сильнее чесаться, образовываться синяк и легче заражаться.

Кожа претерпевает эти изменения с возрастом по ряду причин.К ним относятся факторы окружающей среды, генетические и клеточные факторы. Гормональные изменения также могут повлиять на кожу, а также воздействие УФ-лучей, что увеличивает риск рака кожи.

Рекомендуемый уход за кожей для пожилых людей уделяет особое внимание увлажнению кожи и защите ее от солнца.

Кожа — это большой сложный орган, выполняющий широкий спектр жизненно важных функций, от защиты людей от патогенов до поддержания нужной температуры тела. Люди не смогли бы жить без кожи.

BIOdotEDU

Кожа человека защищена четырьмя функционально и фенотипически обособленными популяциями резидентных и рециркулирующих Т-клеток памяти

Т-клетки не только глубоко в коже

Кожа — это больше, чем просто пассивный барьер для инфекции — это динамическое иммунное микросредство.Действительно, кожа взрослого человека является домом для около 20 миллиардов Т-клеток памяти; однако мало что известно о составе и функциях этих клеток. Теперь Watanabe et al. характеризуют четыре различные популяции Т-клеток в коже, две резидентные и две рециркулирующие. Резидентные Т-клетки памяти обладали более мощными эффекторными функциями, чем рециркулирующие клетки, а также различной пролиферативной способностью. Кроме того, рециркулирующие клетки возвращались в кожу с разной скоростью. Эти данные предполагают, что разные популяции Т-клеток в коже могут выполнять особую функцию по защите организма от инфекции.

Abstract

Кожа взрослого человека содержит около 20 миллиардов Т-клеток памяти. Ткани эпителиального барьера инфильтрируются комбинацией резидентных и рециркулирующих Т-клеток у мышей, но относительные пропорции и функциональная активность резидентных Т-клеток по сравнению с рециркулирующими Т-клетками на коже человека не оценивались. Мы отделили резидентов от рециркулирующих Т-клеток у привитых человеком мышей и пациентов с лимфомой, используя алемтузумаб, лекарство, которое истощает рециркулирующие Т-клетки из кожи, а затем проанализировали эти популяции Т-клеток в здоровой коже человека.Все нерециркулирующие резидентные Т-клетки памяти (T _RM ) экспрессировали CD69, но большинство из них были CD4 ⁺ , CD103 ^– и располагались в дерме, в отличие от исследований на мышах. И CD4 ⁺ , и CD8 ⁺ CD103 ⁺ T _RM были обогащены в эпидермисе, обладали мощными эффекторными функциями и имели ограниченную пролиферативную способность по сравнению с CD103 ^— T _RM . T _RM обоих типов обладали более мощными эффекторными функциями, чем рециркулирующие Т-клетки.Мы наблюдали две различные популяции рециркулирующих Т-клеток: CCR7 ⁺ / L-селектин ⁺ Т-клетки центральной памяти (T _CM ) и CCR7 ⁺ / L-селектин ^— Т-клетки, которые мы называем мигрирующими. Т-клетки памяти (Т _ММ ). Циркулирующие кожно-тропные T _MM занимали промежуточное положение по продукции цитокинов между T _CM и эффекторными Т-клетками памяти. У пациентов с кожной Т-клеточной лимфомой злокачественные T _CM и T _MM вызывали отчетливые воспалительные поражения кожи, а T _MM выводился из кожи медленнее после алемтузумаба, что позволяет предположить, что T _MM может рециркулировать медленнее.Таким образом, кожа человека защищена четырьмя функционально различными популяциями Т-клеток, двумя резидентными и двумя рециркулирующими, с разными территориями миграции и различными функциональными активностями.

ВВЕДЕНИЕ

Исследования на мышах и людях подтвердили, что кожа и другие ткани эпителиального барьера заселены комбинацией нерециркулирующих резидентных Т-клеток памяти (Т _RM ), а также Т-клеток, которые рециркулируют в тканях и из них ( 1 , 2 ).Однако относительные пропорции и функциональная активность резидентных и рециркулирующих Т-клеток в коже никогда не изучались всесторонне, особенно у людей. T _RM вызывает псориаз и грибовидный микоз (MF) и участвует во множестве других аутоиммунных и воспалительных состояний человека ( 3 ). Лучшее понимание резидентных и рециркулирующих Т-клеток может привести к новым методам лечения воспалительных заболеваний, опосредованных Т-клетками.

Наши предыдущие исследования пациентов с кожной Т-клеточной лимфомой (CTCL) показали, что лечение алемтузумабом, гуманизированным анти-CD52 антителом, истощило все циркулирующие Т-клетки и очистило кожу от рециркулирующих Т-клеток, но сохранило популяцию нерециркулирующих Т-клеток. _RM в коже ( 2 ).Алемтузумаб истощает Т-клетки в кровотоке, но не в коже, потому что он истощается из-за антителозависимой клеточной цитотоксичности, требующей присутствия нейтрофилов и / или естественных клеток-киллеров, типов клеток, которые редко встречаются в периферических тканях человека, таких как кожа, но часто встречаются в тираж ( 2 , 4 ).

В этих исследованиях мы изучали резидентные и рециркулирующие субпопуляции Т-клеток на модели мышей с привитыми людьми и на людях с CTCL, используя алемтузумаб в качестве инструмента для истощения рециркулирующих Т-клеток из кожи.Это позволило нам различать резидентные и рециркулирующие популяции Т-клеток в коже человека и изучить их относительную частоту и эффекторные функции. Мы обнаружили, что кожа человека защищена двумя разными популяциями рециркулирующих Т-клеток и двумя разными популяциями T _RM , каждая из которых обладает разными функциональными возможностями.

РЕЗУЛЬТАТЫ

( A ) Модель мыши с привитой человеком была использована для различения резидентных и рециркулирующих Т-клеток в коже. Мышам NSG прививали крайнюю плоть человека и внутривенно вводили аллогенные PBMC человека, а алемтузумаб (αCD52) использовали для истощения рециркулирующих человеческих Т-клеток из пересаженной кожи человека. ( B — E ) Крайняя плоть человека содержала резидентные APC, но мало Т-клеток.(B) Окрашивание с помощью проточной цитометрии переваренной коллагеназой крайней плоти продемонстрировало, что в крайней плоти присутствовали как CD11c ⁺ DC, так и CD1a ⁺ . (C) Приблизительно в четыре раза больше DC, чем Т-клеток, присутствовало в крайней плоти, как было определено по проценту жизнеспособных клеток каждого типа в крайней плоти, переваренной коллагеназой. (D) Т-клетки встречались в 45 раз чаще в коже здорового взрослого человека, чем в крайней плоти; показан процент CD3 ⁺ Т-клеток в крайней плоти, переваренной коллагеназой, по сравнению с кожей взрослого человека.(E) В нескольких Т-клетках, присутствующих в крайней плоти человека, отсутствовали маркеры, характерные для T _RM . Показаны процентные доли Т-клеток, экспрессирующих каждый маркер, в обработанной коллагеназой крайней плоти и коже взрослого человека. Показаны среднее значение и SEM для четырех крайней плоти (от C до E) и семи взрослых доноров кожи (D и E) (тест: t test). ( F — H ) Аллогенные PBMC, вводимые внутривенно пересаженным мышам, мигрировали специфически в трансплантат кожи человека и вызывали воспалительный дерматит.Изображения представляют восемь мышей, которым вводили РВМС, и восемь мышей, которым вводили физиологический раствор. (F) Раздел, окрашенный гематоксилином и эозином (H&E), демонстрирующий соединение между мышиной и кожей человека у трансплантированных мышей. (G) Окраска H&E, изображение воспалительного дерматита × 20. (H) Криосрезы трансплантированной кожи человека, иммуноокрашенные на CD3 (красный) и кератин (зеленый). Т-клетки были обнаружены как в дерме, так и в эпидермисе. Дермоэпидермальное соединение обозначено белой линией. ( I ) В отсутствие инфузионных аллогенных РВМС не наблюдалось воспалительного инфильтрата, и в коже не было визуализировано мало Т-клеток или они отсутствовали.( J ) Повышающая регуляция CD69 предшествовала повышающей регуляции CD103 в Т-клетках, мигрирующих в трансплантаты кожи человека. Трансплантаты кожи человека собирали в указанные моменты времени и переваривали коллагеназой, а Т-клетки анализировали на экспрессию CD69 и CD103 с помощью проточной цитометрии. Показаны среднее значение и SEM для двух пересаженных мышей на момент времени (тест: t тест). нс, не имеет значения. ( K и L ) Популяции Т-клеток в трансплантированной коже повторяют те, которые наблюдаются в коже взрослого человека.Показана Т-клеточная экспрессия маркеров T _CM (CCR7 / L-селектин) и T _RM (CD69 / CD103) по данным проточной цитометрии. Т-клетки выделяли путем расщепления коллагеназой из кожи здорового взрослого человека (HS) или из кожных трансплантатов мышей, подвергнутых инфузии PBMC. Показаны репрезентативные гистограммы (K), а также среднее и SEM экспрессии CD69 и CD103. Показаны среднее значение и SEM трех трансплантатов и семи доноров здоровой кожи (тест: t test).

Алемтузумаб истощает рециркулирующий T

Наши предыдущие исследования у пациентов с CTCL, получавших алемтузумаб, показали, что этот препарат истощает Т-клетки в крови и очищает кожу от рециркулирующих Т-клеток. со временем, но сохранил популяцию нерециркулирующего T _RM в коже ( 2 ).Подобно нашим результатам у пациентов с CTCL, лечение мышей с трансплантированной крайней плотью, инъецированных PBMC алемтузумабом приводило к истощению циркулирующих Т-клеток из крови, но сохраняло субпопуляцию Т-клеток в коже (рис. 2, A и B). Напротив, A-dmDT (390) -bisFv (UCHT1), рекомбинантный иммунотоксин, состоящий из дифтерийного токсина, конъюгированного с анти-CD3, полностью истощил Т-клетки как в крови, так и в коже (рис. 2, A и B). У пациентов с CTCL алемтузумаб истощал кожу рециркулирующего CCR7 ⁺ / L-селектина ⁺ / T _CM , популяция, которая также наблюдается в здоровой коже ( 2 , 7 ).Точно так же алемтузумаб истощил как CD4 ⁺ , так и CD8 ⁺ T _CM из кожных трансплантатов на привитых человеком мышах (рис. 2, C и D).

( A и B ) Человеческие Т-клетки, выделенные из периферической крови (кровь) и переваренные коллагеназой трансплантаты крайней плоти (кожа), окрашенные на CD3 и проанализированные с помощью проточной цитометрии.Образцы получали от мышей с привитыми людьми после лечения либо контрольным иммуноглобулином G (IgG), либо алемтузумабом (αCD52), либо анти-CD3 дифтерийным иммунотоксином A-dmDT (390) -bisFv (UCHT1) (αCD3-DT). Типичные точечные графики (A) и агрегированные данные (B) показаны для четырех мышей, которым инъецировали контрольный IgG (алемтузумаб), шести мышей, которым вводили алемтузумаб, двух контрольных мышей, которым вводили IgG (контроль αCD3-DT), и двух мышей, которым вводили αCD3-DT –Обработанные мыши. ( C ) CCR7 ⁺ / L-селектин ⁺ T _CM присутствовали в крови и коже мышей, привитых к человеку, и истощались в коже под действием алемтузумаба.Показаны Т-клетки, выделенные из крови и кожи контрольных мышей, получавших IgG, и из кожи мышей, получавших алемтузумаб (αCD52) с привитыми людьми. ( D ) Совокупные данные, показывающие истощение CCR7 ⁺ / L-селектина ⁺ T _CM в кожных трансплантатах мышей, привитых человеком, обработанных контрольным IgG (-) или алемтузумабом (+). Показано истощение Т _CM среди популяций Т-клеток CD3 ⁺ , CD4 ⁺ и CD8 ⁺ . Показаны среднее значение и стандартная ошибка среднего для трех пересаженных мышей на группу.Для сравнения показано количество CCR7 ⁺ / L-селектин ⁺ T _CM в коже пяти пациентов с CTCL (CTCL) до (-) и после (+) терапии алемтузумабом.

Отдельные популяции нерециркулирующих T

Установлено, что популяции клеток у мышей с привитыми людьми были сопоставимы с популяциями в здоровой коже человека и что алемтузумаб истощил рециркулирующие Т-клетки в этой модели как и у людей (рис.1 и 2), мы решили изучить нерециркулирующие популяции T _RM , оставшиеся в трансплантатах кожи человека после лечения алемтузумабом. Подавляющее большинство T _RM , остающееся в коже после истощения рециркулирующих Т-клеток алемтузумабом, экспрессировало CD69, а подмножество коэкспрессировало CD103 (фиг. 3A). У мышей, привитых к человеку, Т-клетки CD4 ⁺ встречались в четыре раза чаще, чем Т-клетки CD8 ⁺ , как до, так и после истощения рециркулирующих Т-клеток алемтузумабом, что позволяет предположить, что клетки CD4 преобладали как в популяции рециркулирующих, так и резидентных Т-клеток в этой модели (рис.3Б). Примерно половина CD8 ⁺ T _RM экспрессировала CD103, но большая часть CD4 ⁺ T _RM не экспрессировала (фиг. 3C). При оценке T _RM в целом наиболее частой популяцией были CD4 ⁺ CD103 ^— Т-клетки, которые составляли около 66% от общей популяции T _RM (рис. 3D). CD8 ⁺ Т-клетки составляли 17% популяции T _RM , и только 26% всей популяции T _RM экспрессировали CD103. CD69 ⁺ Т-клетки были обнаружены как в эпидермисе, так и в дерме трансплантатов от мышей, которым трансплантировали алемтузумаб, и только часть этих Т-клеток, как в эпидермисе, так и в дерме, коэкспрессировала CD103 (рис.3E). Чтобы подтвердить эти результаты на людях, мы изучили Т-клетки, оставшиеся в коже пациентов с CTCL после терапии алемтузумабом. Мы обнаружили, что аналогично результатам у мышей с привитыми людьми, T _RM , оставшийся в коже после алемтузумаба, практически весь экспрессировал CD69, а часть CD4 и CD8 Т-клеток коэкспрессировала CD103 (фиг. 3F). Кроме того, небольшая популяция L-селектина ⁺ CCR7 ^— Т-клеток существовала у мышей с привитыми людьми, здоровой кожи и кожи пациентов с CTCL (рис.2C и рис. S3, A, E и F). Эти клетки не были истощены алемтузумабом и коэкспрессировались CD69, что позволяет предположить, что они представляют собой T _RM (фиг. 2C и фиг. S3, A, E и F).

( A ) T _{Клетки RM} , оставшиеся в трансплантатах кожи человека мышей после лечения алемтузумабом, экспрессировали CD69, а подгруппа коэкспрессировала CD103.( B ) Относительное процентное содержание Т-клеток CD4 ⁺ и CD8 ⁺ в трансплантатах кожи человека существенно не изменилось после лечения алемтузумабом. Показаны проценты от общего количества CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток у трех контрольных мышей, получавших IgG– и четырех мышей, получавших алемтузумаб (αCD52) (тест: тест t ). ( C ) Большинство клеток CD4 ⁺ T _RM были CD69 ⁺ / CD103 ^—, тогда как большинство CD8 ⁺ Т-клеток экспрессировали как CD69, так и CD103.( D ) CD4 ⁺ / CD69 ⁺ / CD103 ^— Т-клетки были наиболее частой популяцией Т _RM у мышей, получавших алемтузумаб с привитыми людьми. Показаны относительные проценты указанных подмножеств T _RM . ( E ) CD103 ⁺ и CD103 ^— T _RM были обнаружены как в эпидермисе, так и в дерме мышей, привитых человеком, после лечения алемтузумабом. ( F ) Подтверждающие исследования на людях продемонстрировали, что CD103 ⁺ и CD103 ^— T _RM также присутствуют в коже человека после лечения алемтузумабом.Показаны CD3 ⁺ Т-клетки, выделенные из здоровой кожи (верхний ряд гистограмм) и кожи пациента с CTCL после лечения алемтузумабом (нижний ряд гистограмм). Подобно находкам у мышей с привитыми людьми, CD69 экспрессировался практически всеми T _RM ; Наблюдались CD4 ⁺ и CD8 ⁺ T _RM обоих подмножеств; и CD4 ⁺ Т-клетки чаще были CD103 ^— , тогда как CD8 ⁺ T _RM чаще были CD103 ⁺ .Результаты являются репрезентативными для данных трех пролеченных пациентов.

Кожа человека, подвергшаяся воздействию антигена, содержит две фенотипически и функционально разные популяции T

Исследования на мышах, перенесших прививку человека, и пациентов с CTCL, получавших алемтузумаб, продемонстрировали наличие двух разных популяций CD69 ⁺ нерециркулирующих T _RM в коже: один с экспрессией CD103, другой — без. Однако относительный процент и эффекторные функции клеток в мышиной модели и у пациентов с Т-клеточной лимфомой, связанной с T-хелпером 2 (T _H 2), вряд ли будут отражать те, которые наблюдаются в здоровой коже человека ( 8 — 11 ).Поэтому мы извлекли и изучили Т-клетки из кожи здорового взрослого человека, ткани, в которой предположительно накопился T _RM за многие годы инфекций и воздействия антигенов.

В коже мышей наиболее часто наблюдаемой и хорошо описываемой субпопуляцией T _RM являются интраэпителиальные CD8 ⁺ CD103 ⁺ Т-клетки, и Т-клетки этого фенотипа также наблюдались после инфицирования ВПГ у людей ( 5 , 6 , 12 , 13 ).Чтобы изучить расположение и пропорцию T _RM в коже человека, мы ферментативно расщепили кожу на эпидермис и дерму и изолировали популяции Т-клеток путем расщепления коллагеназой (рис. 4, от A до C). CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки, коэкспрессирующие CD69 и CD103, были очевидны как в эпидермисе, так и в дерме, хотя CD103 ⁺ T _RM обоих субпопуляций чаще встречались в эпидермисе. CD69 ⁺ CD103 ^— T _RM были более распространены в дерме, и оба CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки имели этот фенотип.CD69 ^— Т-клетки, называемые рециркулирующими Т-клетками, были наименее частой популяцией Т-клеток как в эпидермисе, так и в дерме (рис. 4, B и C).

( A, — C ) Кожу взрослого человека ферментативно разделяли на эпидермис и дерму. Затем Т-клетки выделяли и анализировали с помощью проточной цитометрии на экспрессию маркеров CD69 и CD103 Т _RM .Показаны репрезентативные гистограммы (A) и агрегированные данные от пяти доноров (B и C). Процентное содержание CD69 ⁺ / CD103 ⁺ (CD103 ⁺ T _RM ), CD69 ⁺ / CD103 ^— (CD103 ^— T _RM ) и CD69 ^{— —} (рециркулирующие) Т-клетки в процентах от отдельных подмножеств CD4 ⁺ и CD8 ⁺ показаны на (B), и показаны пропорции каждого в CD3 ⁺ Т-лимфоцитах в целом (C) .CD103 ⁺ T _RM , оба CD4 ⁺ и CD8 ⁺ , наиболее часто встречались в эпидермисе, тогда как CD103 ^— T _RM , как в CD4 ⁺ , так и в CD8 ⁺ T-клетках , чаще встречались в дерме. Рециркулирующие Т-клетки составляли меньшинство среди популяций Т-клеток CD4 ⁺ и CD8 ⁺ в коже. ( D ) CD103 ⁺ T _RM превосходили другие подмножества Т-клеток в продукции эффекторных цитокинов.Показана относительная продукция указанных эффекторных цитокинов CD69 ⁺ / CD103 ⁺ (CD103 ⁺ T _RM ), CD69 ⁺ / CD103 ^— (CD103 ^— T _RM ) и CD69 ^— / CD103 ^— (рециркулирующие) Т-клетки, выделенные из здоровой кожи человека. Подмножества Т-клеток выделяли либо из нефракционированной кожи (вся кожа), либо только из эпидермиса, либо только из дермы. Показаны среднее значение и SEM анализов от трех доноров (вся кожа) и пяти доноров (эпидермис и дерма) [тест: односторонний дисперсионный анализ (ANOVA)].

Затем мы изучили функциональные возможности T _RM и рециркулирующих подгрупп из всей кожи, эпидермиса и дермы. В целом, продукция цитокинов двумя отдельными подмножествами T _RM была выше, чем наблюдаемая в рециркулирующих Т-клетках, что согласуется с их ролью в качестве резидентных иммунных дозорных (рис. 4D). Продукция эффекторных цитокинов CD103 ⁺ T _RM также имела тенденцию быть более устойчивой, чем CD103 ^— T _RM , особенно в отношении продукции интерферона-γ (IFN-γ), фактора некроза опухоли-α (TNFα) и интерлейкин-22 (IL-22).Вместе эти результаты демонстрируют, что две фенотипически и функционально различные популяции T _RM существуют как в компартментах Т-клеток CD4 ⁺ , так и в компартментах Т-клеток CD8 ⁺ в коже человека. CD103 ⁺ Т-клетки были обогащены в эпидермисе и имели тенденцию к увеличению продукции эффекторных цитокинов, тогда как CD103 ^— T _RM чаще встречались в дерме и имели немного более низкие, но все же очень мощные эффекторные функции по сравнению с рециркуляцией. Т-клетки.

Чтобы изучить относительную пролиферативную способность двух субпопуляций T _RM в здоровой коже, мы сначала выделили Т-клетки из эпидермиса и дермы как популяции, обогащенные и истощенные по CD103, соответственно. Т-клетки, выделенные из эпидермиса, сохраняли экспрессию CD103, но быстро теряли функциональную активность и подвергались апоптозу после удаления из кожной среды, подобно поведению CD103 ⁺ T _RM , выделенных из мозга мыши после заражения вирусом везикулярного стоматита ( 14 ) (рис.S2, от A до E). Чтобы изучить антигенные реакции и пролиферативную способность без удаления Т-клеток с кожи, мы вводили стимулирующие анти-CD3 и анти-CD28 антитела или антиген, полученный из убитых нагреванием Candida albicans или Staphylococcus aureus непосредственно в эксплантаты кожи человека. Введенные эксплантаты кожи культивировали в течение 2 недель, после чего собирали Т-клетки. Пролиферацию оценивали окрашиванием на Ki-67, а продукцию цитокинов анализировали с помощью внутриклеточной проточной цитометрии после кратковременной стимуляции форбол 12-миристат 13-ацетатом (PMA) и иономицином (рис.5). В обоих Т-клетках CD4 ⁺ и CD8 ⁺ пролиферация была наибольшей в подгруппе CD103 ^— T _RM в ответ на стимуляцию как антителами, так и антигенами, хотя различия достигли значимости только в Т-клетках CD4 ⁺ ( Рис.5, А и В). Продукция TNFα, как правило, была выше в популяции CD103 ⁺ (рис. 5, B и D). В совокупности эти исследования предполагают, что CD103 ⁺ T _RM обладает превосходными эффекторными функциями, но имеет ограниченную пролиферативную способность.

Кожные эксплантаты инъецировали фосфатно-солевым буфером (PBS), стимулирующими анти-CD3 и анти-CD28 антителами (αCD3) или убитыми нагреванием экстрактами C. albicans и S. aureus . ( A и C ) Две недели спустя Т-клетки, которые мигрировали из кожи, были собраны, и пролиферация CD4 ⁺ T _RM (A) и CD8 ⁺ T _RM ( C) анализировали окрашиванием на Ki-67 и анализом проточной цитометрии.Продукция TNFα определялась окрашиванием внутриклеточных цитокинов и анализом проточной цитометрии после стимуляции PMA и иономицином. ( B и D ) Результаты для CD4 ⁺ T _RM (B) и CD8 ⁺ T _RM (D). Результаты показаны для CD69 ⁺ / CD103 ⁺ (CD103 ⁺ T _RM ) и CD69 ⁺ / CD103 ^— (CD103 ^— T _RM ). Показаны среднее значение и SEM трех доноров (PBS) и шести доноров (все другие условия) (тест: t test).

Т-клеточная индукция CD103 усиливается при контакте с кератиноцитами, зависит от трансформирующего фактора роста β и не зависит от адгезии Т-клеточных кератиноцитов

В моделях вирусной кожной инфекции на мышах экспрессия CD103 Т-клетками требует проникновения в эпидермис и зависит на трансформирующий фактор роста — β (TGFβ) ( 15 , 16 ). У мышей, привитых к человеку, Т-клетки, которые мигрировали в эпидермис, имели более высокий уровень CD103-положительности, чем дермальные Т-клетки (рис.6, А и Б). Чтобы определить, может ли контакт кератиноцитов индуцировать повышающую регуляцию CD103 Т-лимфоцитов человека, мы культивировали Т-клетки, стимулированные гранулами αCD3 / αCD2 / αCD28, на монослоях кератиноцитов или фибробластов, находящихся в прямом контакте или разделенных трансвеллерами. Повышающая регуляция CD103 усиливалась за счет прямого контакта с кератиноцитами (фиг. 6C). Чтобы определить, участвуют ли адгезивные взаимодействия между Т-клетками и кератиноцитами в передаче сигналов, необходимых для индукции CD103, мы включили блокирующие функцию антитела против E-кадгерина, LFA-1 и интегринов β _-1 в монослойные культуры Т-клеток и кератиноцитов (рис.6D). Блокирование адгезивных взаимодействий не влияло на повышающую регуляцию CD103, но нейтрализующие антитела против TGFβ снижали индукцию CD103. Дополнительные исследования в трансвеллерах и в прямых совместных культурах продемонстрировали, что нейтрализация TGFβ снижает повышающую регуляцию CD103, вызванную контактом с кератиноцитами, и что рекомбинантный человеческий TGFβ заметно увеличивает индукцию CD103 как в присутствии, так и в отсутствие контакта с кератиноцитами (рис. 6, E и F). ). Хотя адгезивные взаимодействия между E-кадгерином кератиноцитов и CD103 не участвовали в стимуляции индукции CD103, эти взаимодействия действительно функционировали, чтобы закрепить Т-клетки на монослоях кератиноцитов.

( A и B ) У мышей с привитыми людьми Т-клетки, которые мигрировали в эпидермис, имели более высокую скорость активации CD103, чем дермальные Т-клетки. (A) Репрезентативные иммуноокрашивания кожных трансплантатов крайней плоти человека через 3 недели после внутривенной инъекции CD103 ^— PBMC. CD103 ⁺ Т-клетки были преимущественно локализованы в эпидермальном компартменте.Дермо-эпидермальное соединение выделено белой линией. (B) Среднее значение и SEM восьми отдельных экспериментов (тест: t тест). ( C ) Контакт с кератиноцитами индуцировал повышенную регуляцию CD103 в Т-клетках CD4 ⁺ из крови человека, стимулированных гранулами αCD3 / αCD2 / αCD28. CD4 ⁺ Т-клетки были выделены из периферической крови человека разделением магнитных шариков, а затем совместно культивированы в прямом контакте с конфлюэнтными монослоями кератиноцитов (ker) или фибробластов (fib) человека или в транс-лунках, отделенных от монослоев кератиноцитов или фибробластов (косвенно) на 1 неделю в присутствии шариков αCD3 / αCD2 / αCD28.Затем экспрессию CD103 оценивали с помощью иммуноокрашивания и анализа проточной цитометрии. Показаны среднее значение и стандартная ошибка среднего из четырех отдельных экспериментов (тест: ANOVA). ( D ). Блокирование адгезивных взаимодействий с кератиноцитами не влияет на повышающую регуляцию CD103, но нейтрализация TGFβ действительно снижает индукцию CD103. CD4 ⁺ Т-клетки культивировали на конфлюэнтных монослоях кератиноцитов человека в течение 1 недели в присутствии гранул αCD3 / αCD2 / αCD28 и указанных контрольных и блокирующих функцию антител.Показаны среднее значение и стандартная ошибка среднего из четырех экспериментов (тест: ANOVA). ( E и F ) TGFβ-нейтрализующие антитела уменьшались, а экзогенный TGFβ увеличивал индукцию CD103. Т-клетки культивировали в трансвеллерах напротив монослоев кератиноцитов (E) или непрямого контакта с монослоями кератиноцитов (F) в течение 1 недели в присутствии шариков αCD3 / αCD2 / αCD28 и указанных нейтрализующих антител к TGFβ (αTGFβ) или рекомбинантного человеческого TGFβ (hTGFβ). ). Показаны среднее значение и стандартная ошибка среднего из двух отдельных экспериментов (тест: ANOVA).( G ) Антитела, блокирующие функцию E-кадгерина, ингибировали адгезию Т-клеток к монослоям кератиноцитов. CD4 ⁺ Т-клетки культивировали на конфлюэнтных монослоях кератиноцитов человека в течение 1 недели в присутствии шариков αCD3 / αCD2 / αCD28 в присутствии изотипического контроля или антител, блокирующих функцию E-кадгерина. Неприкрепленные Т-клетки удаляли промыванием, а затем прикрепленные Т-клетки элюировали из лунок обработкой трипсином / ЭДТА. Показаны среднее значение и SEM количества прикрепившихся клеток на лунку из трех отдельных экспериментов (тест: t test).

Кожа человека также содержит две отдельные популяции рециркулирующих Т-клеток памяти

Ранее мы сообщали, что здоровую кожу человека патрулировала кожно-тропная популяция T _CM , которая коэкспрессирует оба рецептора, возвращающие к коже (CLA / CCR4), и маркеры центральной памяти (CCR7 / L-селектин) и были истощены при терапии алемтузумабом ( 2 ). Однако при рассмотрении наших результатов мы обнаружили, что и здоровая кожа, и кожа пациентов с CTCL содержали отдельную популяцию CCR7 ⁺ / L-селектин ^— Т-клеток (рис.7, А и Б). CCR7 ⁺ / L-селектин ^— Т-клетки были ограничены дермой и отсутствовали в эпидермисе (рис. S3A). Около трети CCR7 ⁺ / L-селектина ^— Т-клеток коэкспрессировали CD69, что позволяет предположить, что они могут быть Т-клетками в переходном состоянии, но оставшиеся CCR7 ⁺ / L-селектин ^— / CD69 ^— Т-клетки составляли значительную часть Т-клеток как у здоровой кожи, так и у пациентов с CTCL (рис. 7B). Эти Т-клетки были истощены у пациентов с CTCL при терапии алемтузумабом, демонстрируя, что они представляют собой рециркулирующую популяцию Т-клеток (рис.7, А и Б). У мышей экспрессия CCR7 необходима для выхода из периферических тканей через лимфатические сосуды, и было обнаружено, что рециркулирующая популяция CD4 ⁺ / CCR7 ⁺ / L-селектин ^lo Т-клеток у мышей Kaede рециркулирует из кожи в CCR7-зависимый способ ( 17 — 19 ). CCR7 ⁺ / L-селектин ^{— клетки} , которые мы будем называть Т-лимфоцитами миграционной памяти (Т _MM ), присутствовали в аналогичных пропорциях как в здоровой коже, так и среди доброкачественных незлокачественных Т-клеток у пациентов с CTCL, и эти клетки были полностью истощены терапией алемтузумабом (рис.7Б). Т _MM составлял большую часть как CD4 ⁺ , так и CD8 ⁺ CLA ⁺ кожно-тропных Т-клеток в крови здоровых доноров-людей, подтверждая, что Т-клетки действительно рециркулируют между кровью и кожей (рис. 7C, типичные гистограммы на фиг. S4). Затем мы выделили кожно-тропные (CLA ⁺ ) T _CM , T _MM и эффекторные Т-клетки памяти (T _EM ) из ​​крови человека и сравнили их относительные функциональные возможности после стимуляции PMA и иономицином, а затем комплексный клеточный фенотип по данным масс-цитометрии CyTOF (рис.7D). В целом, продукция эффекторных цитокинов T _MM была промежуточной между T _EM и T _CM . Продукция провоспалительных эффекторных цитокинов T _H 1, T _H 17 и T _H 22 была самой высокой в ​​T _EM , но продукция цитокинов T _H 2 (IL-4 и IL-13) была самой высокой. в Т _СМ . TNFα продуцируется на высоком уровне всеми субпопуляциями Т-клеток. Несмотря на незначительные различия, продукция IL-2, о которой ранее сообщалось как об особенности T _CM , которая может придавать им устойчивость к апоптозу, имела тенденцию быть выше в рециркулирующих популяциях T _CM и T _MM , чем в T _EM. ( 20 ).

( A ) CCR7 ⁺ / L-селектин ^— Т-клетки присутствовали в здоровой коже человека и коже пациентов с CTCL и были истощены терапией алемтузумабом. ( B ) Доля Т _MM (CCR7 ⁺ / L-селектин ^— / CD69 ^— Т-клетки) у 10 здоровых доноров кожи (NS) и 10 пациентов с CTCL до (untx) и после ( αCD52) терапия алемтузумабом (тест: t тест).( C ) T _MM являются наиболее частой популяцией Т-клеток памяти CLA ⁺ в крови человека. Относительные проценты CCR7 ⁺ / L-selectin ⁺ T _CM , CCR7 ⁺ / L-selectin ^— T _MM и CCR7 ^— / L-selectin ^— T _{Показаны Т-клетки EM} в Т-клетках CD4 ⁺ и CD8 ⁺ из периферической крови человека. Показаны среднее значение и стандартная ошибка среднего для четырех доноров. Репрезентативные гистограммы представлены на рис.S4. ( D ) Эффекторные функции циркулирующего T _MM являются промежуточными между функциями T _CM и T _EM . Для (C) и (D) Т-клетки выделяли из периферической крови, стимулировали PMA и иономицином в присутствии ингибитора выделения L-селектина, окрашивали на поверхностные маркеры и внутриклеточно на продукцию цитокинов, а затем анализировали с помощью масс-спектрометрии CyTOF. . Показаны среднее значение и стандартная ошибка среднего четырех доноров (тест: ANOVA).

T

CLA ⁺ кожно-тропический CCR7 ⁺ / L-селектин ^— T _MM явно рециркулируют между кровью и кожей человека, о чем свидетельствует их присутствие в обоих участках и их истощение алемтузумабом у пациентов с CTCL.Ожидается, что T _MM , покидая кожу через лимфатические сосуды, попадет в дренирующие кожу лимфатические узлы и, в конечном итоге, снова войдет в кровоток через грудной проток. Однако в этих клетках отсутствует L-селектин, и они, вероятно, не могут получить доступ к лимфатическим узлам из крови, как думают наивные Т-клетки и T _CM , мигрируя по участкам высокого эндотелия ( 21 , 22 ). Вместо этого ожидается, что эти Т-клетки вернутся обратно в кожу. Чтобы изучить биологическое поведение этих клеток у людей in vivo, мы изучили пациентов с CTCL со злокачественными Т-клетками, которые экспрессировали маркеры T _MM .Ранее мы наблюдали, что пациенты с классическим синдромом Сезари, состоящим из клинической триады диффузной эритемы кожи, увеличения лимфатических узлов, дренирующих кожу и другие органы, и циркулирующих злокачественных Т-клеток в крови, имеют злокачественные Т-клетки с фенотип кожно-тропного Т _CM ( 2 , 23 ). CLA ⁺ T _{Ожидается, что CM} будет рециркулировать между кожей, кровью и лимфатическими узлами в соответствии с нашим текущим пониманием трафика, и именно здесь злокачественные Т-клетки накапливаются у пациентов Сезари.Более того, мы обнаружили, что злокачественные Т-клетки фенотипа CLA ⁺ T _CM индуцировали у пациентов диффузную эритему кожи и что эта диффузная эритема была лучшим клиническим предиктором полной ремиссии в ответ на терапию алемтузумабом (рис. 8A). ) ( 24 ). Тем не менее, пациенты имеют множество клинических проявлений, и мы обнаружили, что у некоторых пациентов наблюдаются эритематозные поражения кожи с нечеткими границами, в отличие от пациентов с синдромом Сезари, у которых наблюдается диффузная эритема, и пациентов с МФ, которые имеют с фиксированными, рецидивирующими и резко очерченными воспалительными поражениями кожи (рис.8). Мы обнаружили, что пациенты со злокачественными Т-клетками, которые имели фенотип CCR7 ⁺ / L-селектин ^— T _MM , имели тенденцию иметь поражение только лимфатических узлов, дренирующих кожу, и имели расширяющиеся воспалительные поражения кожи с тяжелыми заболеваниями. определены границы (рис. 8, B – D). У одного пациента злокачественные Т-клетки в крови и коже представляли собой комбинацию T _CM и T _MM . У этого пациента фоновая диффузная эритема, а также более дискретные поражения кожи при поступлении (рис.8E). После 18 дней приема алемтузумаба повторная биопсия кожи показала, что T _CM был частично истощен, но большое количество T _MM осталось в коже. Это было связано с разрешением диффузной эритемы, но сохранением эритематозных поражений кожи. В совокупности отсутствие заболевания лимфатических узлов, клинические проявления этих поражений и тот факт, что T _CM выводился из кожи быстрее, чем T _MM после терапии алемтузумабом, позволяют предположить, что T _MM действительно циркулирует в крови. и кожа, исключены из лимфатических узлов и могут рециркулировать медленнее, чем T _CM .

( A ) CTCL со злокачественными Т-клетками фенотипа T _CM (CCR7 ⁺ / L-селектин ⁺ ) наблюдалась диффузная эритема кожи. ( B — D ) Напротив, пациенты с CTCL, у которых злокачественные Т-клетки имеют фенотип T _MM (CCR7 ⁺ / L-селектин ^—) в пораженной коже (B и C) или крови (D), представлен расширяющимися отдельными кожными поражениями с нечеткими границами.( E ) Пациент, у которого были злокачественные Т-клетки обоих фенотипов T _CM и T _MM , имел как диффузную эритему при представлении, так и отдельные кожные поражения с нечеткими границами. Пациенту была назначена терапия алемтузумабом, и через 18 дней была проведена повторная биопсия кожи. ( F ) Через восемнадцать дней после начала приема алемтузумаба дискретная эритема отступила, оставив нечеткие поражения кожи. Анализ Т-клеток кожи продемонстрировал относительное истощение T _CM , но сохранение T _MM в коже.

ОБСУЖДЕНИЕ

Поверхность кожи здорового взрослого человека содержит около 20 миллиардов различных Т-клеток памяти с мощными эффекторными функциями ( 7 ). Наши предыдущие исследования с участием пациентов с CTCL, получавших алемтузумаб, продемонстрировали, что кожа человека содержит комбинацию резидентных и рециркулирующих Т-клеток памяти, но относительная частота и функциональная активность этих подгрупп остаются нехарактеризованными ( 2 ). В текущих исследованиях мы использовали алемтузумаб в качестве инструмента для истощения рециркулирующих Т-клеток из кожи, чтобы различать популяции рециркулирующих и T _RM .

Мы разработали привитую человеком модель мыши для изучения резидентных и рециркулирующих популяций Т-клеток в коже. Мышам с иммунодефицитом прививали крайнюю плоть новорожденного человека, ткань, которая содержит резидентные LC и DC, но мало Т-клеток. Малочисленность резидентных Т-клеток в трансплантате позволила нам быть более уверенными в том, что Т-клетки, наблюдаемые в коже после аллогенной внутривенной инфузии РВМС, были получены из внутривенно введенных Т-клеток. T _RM обычно образуются в результате кожных инфекций.Мы воспользовались тем фактом, что резидентные APC, вероятно, активируют Т-клетки, мигрирующие в трансплантат из крови посредством прямого алло-узнавания, прямого распознавания главного комплекса гистосовместимости (MHC) I и II аллогенными CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клетки соответственно. Прямое алло-распознавание вызывает устойчивый поликлональный Т-клеточный ответ, вовлекающий до 10% Т-клеток ( 25 ). То есть мы использовали аллогенный Т-клеточный ответ для взаимодействия с Т-клеточным рецептором (TCR) и запуска программы дифференцировки T _RM в трансплантированной коже.Мы наблюдали развитие CD69 ⁺ и CD103 ⁺ Т-клеток в трансплантированной коже в пропорциях, аналогичных таковым в коже взрослого человека. Однако распознавание антигена аллогенных тканей, вероятно, продолжается у мышей, привитых к человеку, и некоторые CD103 ^— Т-клетки могут находиться в процессе перехода на CD103 ⁺ T _RM .

Затем мы обработали этих мышей алемтузумабом, чтобы отличить рециркулирующие подгруппы от T _RM .Подобно нашим предыдущим результатам у пациентов с CTCL, получавших алемтузумаб, алемтузумаб очистил кожу от рециркулирующего T _CM , но сохранил популяцию Т-клеток в коже. Напротив, иммунотоксин A-dmDT (390) -bisFv (UCHT1), рекомбинантный дифтерийный иммунотоксин против CD3, который в настоящее время проходит испытания для лечения CTCL, полностью истощил Т-клетки как в крови, так и в коже пересаженных мышей ( 26 ).

Мы наблюдали, что практически все Т-клетки, оставшиеся в коже пересаженных мышей после алемтузумаба, экспрессировали CD69, и аналогичные результаты наблюдались у пациентов с CTCL, получавших алемтузумаб.У мышей нерециркулирующий Т _RM , полученный в результате экспериментальных инфекций, экспрессировал CD69, и было показано, что популяции Т-клеток в периферических тканях человека также экспрессируют этот маркер ( 1 , 7 , 27 ). CD69 подавляет активность сфингозин-1-фосфатного рецептора 1 (S1P1), и было обнаружено, что подавление S1P1 у мышей необходимо для удержания CD8 ⁺ T _RM в коже ( 16 , 28 ). Однако на людях никогда не было убедительно продемонстрировано, что CD69 идентифицирует пул нерециркулирующих Т-клеток в периферических тканях.Наши исследования на мышах с привитыми людьми и на людях, получавших алемтузумаб, демонстрируют, что CD69 является отличным маркером нерециркулирующего T _RM в коже человека.

Большинство T _RM , генерируемых вирусными инфекциями у мышей, представляют собой сидячие CD8 ⁺ Т-клетки, экспрессирующие CD69 и CD103, локализованные в эпителии, хотя кожные CD4 ⁺ T _RM с большей подвижностью также наблюдались после Инфекция HSV ( 1 , 5 , 6 , 29 ).Наши исследования на привитых мышах, пациентах с CTCL и здоровой коже человека демонстрируют, что большинство Т _RM кожи человека представляют собой дермальные Т-клетки CD4 ⁺ , у которых отсутствует экспрессия CD103. Однако мы обнаружили, что Т-клетки CD103 ⁺ , как CD4 ⁺ , так и CD8 ⁺ , обогащены эпидермисом. Что касается их функциональных возможностей, CD103 ⁺ T _RM обладали более мощными эффекторными функциями, но меньшей пролиферативной способностью. Т-клетки, выделенные из эпидермиса, которые обогащены CD103 ⁺ T _RM , быстро подвергались апоптозу при удалении из микросреды кожи и обладали плохой пролиферативной способностью; эти результаты очень похожи на поведение CD103 ⁺ T _RM , выделенного из мозга мышей после заражения вирусом везикулярного стоматита ( 14 ).

Было показано, что повышающая регуляция CD103 кожными Т-клетками на моделях мышей происходит после проникновения в эпидермис и зависит от TGFβ ( 15 ). Второе исследование показало, что IL-33 и TNFα также могут вносить свой вклад ( 16 ). Мы наблюдали у мышей с привитыми людьми, что Т-клетки, которые мигрировали в эпидермис, имели более высокие уровни CD103, чем дермальные Т-клетки. Предполагая, что контакт с кератиноцитами может участвовать в повышении регуляции CD103, мы обнаружили, что прямое культивирование стимулированных Т-клеток крови с монослоями кератиноцитов усиливает экспрессию CD103 способом, который зависит от TGFβ, но не требует адгезионных взаимодействий между Т-клетками и кератиноцитами.Более того, экзогенный TGFβ заметно усиливал индукцию CD103 в присутствии или в отсутствие прямого контакта с кератиноцитами. Хотя передача сигналов от интегрина и адгезивных взаимодействий, опосредованных CD103-E-cadherin, не усиливает повышающую регуляцию CD103, взаимодействия CD103-E-cadherin действительно служат для привязки T-клеток к монослоям кератиноцитов. В совокупности эти исследования предполагают, что CD103 в человеческих Т-клетках активируется с помощью TGFβ, продуцируемого в эпидермальном компартменте. Хотя адгезивные взаимодействия с кератиноцитами не вызывают повышающую регуляцию CD103, CD103, вероятно, участвует в связывании Т-клеток в эпидермальном компартменте.

Таким образом, мы обнаружили, что кожа человека населена комбинацией CD103 ⁺ и CD103 ^— T _RM , с преобладающим CD4 ⁺ T _RM . Преобладание CD4 ⁺ T _RM в коже человека может отражать разнообразие воздействия антигена, с которым сталкиваются люди на протяжении всей их жизни.

Большинство моделей мышей поколения T _RM используют вирусы для индукции образования T _RM , включая инфекцию HSV и коровьей оспы, и эти мыши содержатся в условиях барьера, свободного от патогенов, для предотвращения других инфекций ( 5 , 6 ).Напротив, наши здоровые взрослые доноры кожи человека будут подвергаться сочетанию вирусных, бактериальных, грибковых и, возможно, паразитарных инфекций. Стоит отметить, что антигенные особенности кожи человека T _RM представляют собой ценную иммунологическую запись о том, с какими инфекционными патогенами и антигенами человек сталкивался в течение своей жизни. Более того, в цитокиновых и эффекторных функциях этих Т-клеток закодирована история того, как эти люди победили каждый патоген.В настоящее время не существует методов, позволяющих экстраполировать специфичность антигена из последовательностей TCR. Однако, как только такие методы будут разработаны, мы сможем исследовать иммунологический анамнез человека по Т-клеткам, остающимся в их коже. Недавние исследования на мышах показали, что воздействие кожных антигенов заставляет отдельные наивные Т-клетки дифференцироваться в примерно равное количество резидентных Т _RM и рециркулирующих Т _CM , предполагая, что иммунные реакции в коже генерируют идентичные резидентные и рециркулирующие Т-клеточные субпопуляции TCR. ( 30 ).

Мы идентифицировали рециркулирующие субпопуляции Т-клеток, изучая популяции Т-клеток, которые были истощены с кожи под действием алемтузумаба. Наша предыдущая работа с пациентами с лейкемическим CTCL (L-CTCL), получавшими алемтузумаб, показала, что кожа человека и кожа пациентов с CTCL содержали популяцию Т-клеток, которые коэкспрессировали как адресацины нахождения в коже (CLA / CC4), так и маркеры центральной памяти (CCR7). / L-selectin) ( 2 ). У многих пациентов с L-CTCL злокачественные Т-клетки имели этот фенотип ( 23 ).Алемтузумаб истощил эти Т-клетки из крови и со временем очистил их от кожи, подтверждая, что они рециркулируют. T _CM , как было впервые описано, считалось подмножеством Т-клеток, которые рециркулируют между кровью и лимфатическими узлами и не обладают тканевым тропизмом ( 20 ). Однако кожно-тропный T _CM существует как в коже, так и в крови человека, и можно ожидать, что он будет активно рециркулировать между лимфатическими узлами, кровью и кожей. Действительно, аналогичная популяция рециркулирующих Т-клеток была идентифицирована в коже мышей Kaede ( 17 ).Эти Т-клетки экспрессировали коэкспрессированные CCR7 и L-селектин на промежуточных уровнях и рециркулировали между кровью, кожей и удаленными лимфатическими узлами. Эти Т-клетки имели количественно более низкие уровни экспрессии L-селектина, чем уровни из циркулирующей крови, но экспрессии было достаточно, чтобы позволить этим клеткам рециркулировать через некожные дистальные лимфатические узлы ( 17 ). Поскольку эти Т-клетки могут получать доступ к системным лимфатическим узлам, мы полагаем, что они представляют популяцию мышей, аналогичную клеткам, которые мы называем кожно-тропными T _CM .

Мы также нашли доказательства наличия дополнительной популяции CCR7 ⁺ / L-selectin ^— , рециркулирующих Т-клетки в коже человека, которые мы обозначаем как T _MM . Эта популяция рециркулирующих Т-клеток плохо воспроизводилась в нашей модели привитых мышей, но присутствовала в крови и коже здоровых людей и пациентов с CTCL и была истощена терапией алемтузумабом. У людей CLA ⁺ T _MM были наиболее распространенной субпопуляцией CLA ⁺ Т-клеток памяти в крови.T _MM , вероятно, будет исключен из лимфатических узлов, дренирующих некожные ткани, потому что в них отсутствует L-селектин. Однако они будут получать доступ к дренирующим кожу лимфатическим узлам, когда они мигрируют из кожи в лимфатические узлы, а оттуда в лимфатические узлы, дренирующие кожу. Мы нашли поддержку этой концепции в клинических данных о том, что пациенты со злокачественными Т-лимфоцитами CTCL и T _MM имели тенденцию иметь увеличение только лимфатических узлов, дренирующих кожу (так называемые дерматопатические узлы), но не имели диффузного поражения лимфатических узлов, что часто наблюдается у пациентов. Пациенты с L-CTCL со злокачественными новообразованиями T _MM .

Что касается их функциональных возможностей, T _MM занимали промежуточное положение между T _CM и T _RM в производстве воспалительных цитокинов. Мы обнаружили, что продукция цитокинов T _H 2 была обогащена рециркулирующими Т-клетками (T _MM и T _CM ), но что продукция T _H 1-, T _H 2-, T _H 17- и T _H 22-ассоциированные воспалительные цитокины были обогащены T _EM .IL-2 экспрессировался на более высоких уровнях за счет рециркуляции Т-клеток, что согласуется с возможной ролью этого цитокина в предотвращении апоптоза и поддержании жизнеспособности клеток во время их турбулентной и постоянной миграции через кровоток и ткани.

Хотя данные, которыми мы располагаем, ограничены, наши данные на людях, получавших алемтузумаб, предполагают, что T _MM может рециркулировать через кожу медленнее, чем T _CM . У пациентов с CTCL со злокачественными Т-клетками фенотипа T _MM развились нечеткие, но дискретные поражения кожи, тогда как у пациентов с L-CTCL со злокачественными Т-клетками фенотипа T _CM наблюдалась диффузная, часто полная, эритема кожи (erythroderma ).Мы предполагаем, что диффузная эритема, вызванная злокачественным T _CM , возникает в результате быстрой миграции этих клеток внутрь и из кожи, а также внутри самой кожи. Напротив, T _MM вызывал нечеткие, но дискретные поражения кожи, что согласуется с более медленной миграцией этих Т-клеток в кожу и из кожи, а также внутри самой кожи. Более того, у одного пациента, которого мы смогли изучить, T _MM выводился из кожи медленнее, чем T _CM . Однако альтернативное объяснение может заключаться в том, что T _MM может быть подмножеством T-ячеек, которые приводят к T _RM .В этом случае поражения кожи, которые мы наблюдаем у этих пациентов, могут представлять собой T _MM , дифференцирующуюся in situ в T _RM на участках. Продолжающееся развитие новых расширяющихся кожных поражений у этих пациентов, вероятно, является результатом рециркуляции T _MM , проникающей в новые участки кожи из кровотока и инициирующих новые поражения. Остается определить, представляют ли поражения кожи, генерируемые T _RM , вновь созданный T _RM или просто более медленную миграцию T _MM через кожу.Наконец, неясно, почему T _MM недостаточно представлены у мышей с привитыми людьми. Одна возможность состоит в том, что T _MM может быть основным источником T _RM и поэтому истощается по мере развития T _RM в коже. Вторая возможность заключается в том, что подмножество человеческих Т-клеток может не выжить в микроокружении мыши.

Одно предостережение в отношении наших результатов заключается в том, что, хотя мы и другие группы, изучающие резидентные и рециркулирующие популяции Т-клеток, используем обозначения, такие как T _RM и T _CM , для описания подмножеств Т-клеток, маркеры, такие как CD69 и CCR7, которые используются определение этих предположительно стабильных подмножеств может измениться с активацией Т-клеток.Потребуется дополнительная работа, чтобы точно определить, насколько стабильны эти подмножества Т-клеток, и определить дополнительные, менее вариабельные поверхностные маркеры для их идентификации.

Таким образом, мы представляем полную характеристику резидентных и рециркулирующих Т-клеток памяти в коже человека. Мы обнаружили, что две отдельные популяции T _RM размещаются в коже человека, а две отдельные популяции T-клеток рециркулируют через кожу. Каждая из этих подгрупп имеет различные рециркуляционные и функциональные возможности, и каждая, вероятно, будет играть уникальную роль в защите от известных патогенов.Известно, что как Т _RM , так и рециркулирующие Т-клетки вносят вклад в заболевания человека. Например, псориаз представляет собой нарушение регуляции T _RM , а L-CTCL представляет собой злокачественное новообразование рециркулирующих Т-клеток ( 23 , 31 — 33 ). Недавние открытия на мышах, что T _RM и рециркулирующие Т-клетки имеют очень разные паттерны экспрессии генов, подчеркивают тот факт, что эти типы клеток имеют очень отличную биологию ( 15 ). За исключением настоящего исследования, относительные пропорции резидентных и рециркулирующих Т-клеток в тканях человека остаются нехарактеризованными.Более того, вклад T _RM по сравнению с рециркулирующими Т-клетками в большинстве воспалительных и аутоиммунных заболеваний человека и эффекты противовоспалительной терапии на эти подмножества Т-клеток неизвестны. Поэтому лучшее понимание этих резидентных и рециркулирующих подмножеств Т-клеток имеет решающее значение для понимания здоровых иммунных ответов и определения методов лечения, которые преимущественно нацелены на патогенные Т-клетки при аутоиммунных и воспалительных заболеваниях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

План исследования / план эксперимента

Это экспериментальное лабораторное исследование, проведенное на образцах тканей человека.Все исследования проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией. Кровь у здоровых людей была взята после лейкафереза, а кожа была получена у здоровых пациентов, перенесших процедуры косметической хирургии. Кровь и пораженные участки кожи пациентов с CTCL были получены от пациентов, осматривавшихся в рамках программы по кожной лимфоме Центра рака Дана-Фарбер / Бригама и Женского онкологического центра. Пациенты с L-CTCL и MF, описанные в этой статье, соответствовали критериям Всемирной организации здравоохранения — Европейской организации по исследованию и лечению рака (WHO-EORTC) для синдрома L-CTCL / Сезари или MF ( 34 ).Все ткани были собраны с предварительного одобрения Партнеров и Институционального наблюдательного совета Дана-Фарбер. Подсчет субпопуляций Т-клеток в иммунофлуоресцентных исследованиях проводился слепым методом. Механистические исследования клеток, полученных из крови и тканей человека, были выполнены с использованием анализов in vitro без ослепления или рандомизации. Компоненты исследования не были заранее определены.

Модель мыши с привитым человеком

Неонатальная крайняя плоть человека была прививаема на спину мышей без ожирения / тяжелого комбинированного иммунодефицита / γ-цепи рецептора IL-2 в возрасте от 6 до 8 недель (Лаборатория Джексона).Через неделю после выделения от здоровых доноров центрифугированием фиколла внутривенно инъецировали 5 × 10 ⁶ аллогенных РВМС. Инъекции антител начинали через 2-4 недели после приживления РВМС. Алемтузумаб (2,5 мкг) или изотипический контроль (человеческий IgG1, BioLegend) вводили внутрибрюшинно три раза в неделю в течение 3 недель. Токсин дифтерии против CD3 [A-dmDT (390) -bisFv (UCHT1), 0,625 мкг] или изотипический контроль (человеческий IgG1) вводили внутривенно один раз в день в течение 4 дней. По завершении эксперимента кровь и кожные трансплантаты собирали для анализа с помощью проточной цитометрии, иммунофлуоресценции и / или окрашивания H&E.

Образцы кожи и крови

Протоколы этого исследования были выполнены в соответствии с Хельсинкской декларацией и были одобрены институциональным наблюдательным советом Комитета по исследованиям на людях партнеров (Partners Research Management). Кожа здоровых пациентов была получена у пациентов, перенесших процедуры косметической хирургии, а кровь у здоровых людей была получена как отбракованная ткань после лейкофереза. Крайняя плоть новорожденных была получена от младенцев, перенесших обрезание в Бригаме и женской больнице.Кровь и пораженные участки кожи пациентов с CTCL были получены от пациентов, осматривавшихся в рамках программы по кожной лимфоме Центра рака Дана-Фарбер / Бригама и Женского онкологического центра. Пациенты с L-CTCL и MF, описанные в этой статье, соответствовали критериям ВОЗ-EORTC для CTCL. РВМС выделяли центрифугированием фиколла.

Выделение Т-клеток из кожи

Образцы кожи человека на всю толщину, свежие или после приживления на мышах, тщательно измельчали ​​и затем инкубировали в течение 2 часов при 37 ° C в среде RPMI 1640, содержащей 0.2% коллагеназа типа I (Life Technologies) и дезоксирибонуклеаза I (30 единиц Кунитца / мл, Sigma-Aldrich). После этого клетки собирали путем фильтрации ткани, обработанной коллагеназой, через сетчатый фильтр для клеток 40 мкм. Для некоторых экспериментов эпидермис и дерму разделяли инкубацией в течение ночи в диспазе II (1,4 МЕ / мл, Roche Diagnostics) при 4 ° C с последующим механическим разделением. Затем эпидермис измельчали ​​и инкубировали с диспазой в течение дополнительных 30 мин при 37 ° C при перемешивании с последующей фильтрацией через сито для клеток 40 мкм.Дерму измельчали ​​и обрабатывали коллагеназой в соответствии с протоколом для всей толщины кожи. Клетки цельной кожи, дермы или эпидермиса инкубировали при 37 ° C в течение 2 дней в среде Игла, модифицированной Iscove’s Dulbecco, с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки, пенициллина / стрептомицина, глутамина и 2-меркаптоэтанола перед анализом проточной цитометрии. Если указано (рис. S2), ингибитор панкаспазы Z-VAD-FMK (R&D Systems) был включен в низких (10 мкМ) или высоких (100 мкМ) концентрациях для ингибирования апоптоза.

Проточная цитометрия

Анализ Т-клеток выполняли с использованием непосредственно конъюгированных моноклональных антител, полученных от BD Biosciences, eBioscience, BioLegend, Beckman Coulter или R&D Systems. Соответствующие изотипу антитела отрицательного контроля использовали для установки ворот для положительного окрашивания. Для анализа продукции цитокинов Т-клетки стимулировали либо контрольной средой, либо PMA (50 нг / мл) (Sigma-Aldrich) и иономицином (750 нг / мл) (Life Technologies) плюс брефельдин A (10 мкг / мл) (BD Биологические науки) на 4 часа.Поверхность клеток окрашивали, фиксировали, пермеабилизировали, окрашивали антицитокиновыми антителами и исследовали проточной цитометрией. Для анализа пролиферации клетки окрашивали поверхность, фиксировали, пермеабилизировали, окрашивали антителом против Ki-67 и исследовали проточной цитометрией. Анализ образцов проточной цитометрии выполняли на приборах Becton-Dickinson FACSCanto, а данные анализировали с помощью программного обеспечения FACSDiva (V5.1).

Иммуноокрашивание с помощью криосрезов

Трансплантаты кожи человека залили при оптимальной температуре для резки (OCT), заморозили и хранили при -80 ° C до использования.Криосрезы (5 мкм) вырезали, сушили на воздухе, фиксировали в течение 5 минут в ацетоне, регидратировали в PBS и блокировали человеческим IgG (20 мкг / мл) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) в течение 15 минут при комнатной температуре. Срезы инкубировали с первичным антителом в течение 30 минут, а затем трижды промывали в PBS / 1% бычьем сывороточном альбумине в течение 5 минут. При необходимости добавляли вторичные антитела на 30 мин с последующими тремя промываниями. Срезы монтировали с использованием ProLong Gold Antifade с 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (Life Technologies) и немедленно исследовали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.Антитела были получены из следующих источников: BioLegend (CD3, CD69), LifeSpan BioSciences (CD103), Abcam (цитокератин 15) и Jackson ImmunoResearch (вторичные антитела). Срезы фотографировали с помощью микроскопа (Eclipse 6600; Nikon), оснащенного объективом 40 × / 0,75 (Plan Fluor; Nikon). Изображения были получены с помощью камеры (SPOT RT модель 2.3.1; диагностические инструменты) и были получены с помощью программного обеспечения SPOT 4.0.9 (диагностические инструменты).

Анализ пролиферации и цитокинов клеток, стимулированных внутри эксплантатов

В пробирные биопсии (10 мм) здоровой взрослой кожи вводили 100 мкл PBS (контроль), смесь антител α-CD3 / α-CD28 (0.5 мкг / мл каждый), или убитые нагреванием S. aureus [10 ⁶ / мл, Американская коллекция типовых культур (АТСС)] или C. albicans (5 × 10 ³ / мл, АТСС) . Биопсии помещали во вставки Transwell с размером пор 0,4 мкм в среде X-VIVO 15 (Lonza). Через 2 недели клетки, которые мигрировали из биоптатов, собирали, оставляли в течение ночи в среде X-VIVO 15 и анализировали продукцию цитокинов и пролиферацию с помощью проточной цитометрии, как описано выше. Были проанализированы только клетки, которые мигрировали из эксплантатов.

Исследования регуляции CD103 in vitro

Для получения кератиноцитов здоровую кожу человека разделяли на эпидермис и дерму путем инкубации с диспазой II (1,4 МЕ / мл) (Roche) в RPMI (Life Technologies) при 4 ° C в течение 12 часов. . Эпидермис отделяли от дермы, измельчали, дополнительно расщепляли диспазой (1,4 МЕ / мл) при 37 ° C в течение 30 минут, а затем фильтровали в сетчатом фильтре для клеток. Кератиноциты культивировали до слияния в 24-луночных планшетах с плоским дном с использованием кератиноцитов-SFM (бессывороточная среда) (Life Technologies).Для получения фибробластов дерму измельчали, расщепляли 0,2% коллагеназой / дезоксирибонуклеазой (Sigma-Aldrich) при 37 ° C в течение 2 часов, а затем фильтровали в сетчатом фильтре для клеток. Фибробласты культивировали до слияния в RPMI с добавлением 15% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и эпидермального фактора роста (10 нг / мл). CD3 ⁺ CD4 ⁺ и CD3 ⁺ CD8 ⁺ Т-клетки выделяли с помощью магнитной сепарации (наборы для отрицательной изоляции, Miltenyi Biotec) из здоровых человеческих PBMC. CD103 экспрессировался в среднем 3% выделенных Т-клеток CD8, но в остальном поверхностная экспрессия CD69 и CD103 составляла <1% в этих фракциях Т-клеток.Т-клетки (1 × 10 ⁵ ) стимулировали гранулами для активации Т-клеток αCD3 / CD2 / CD28 (Miltenyi Biotec) в соотношении 1: 2 в течение 24 часов (день 0), а затем добавляли к монослоям кератиноцитов или фибробластов (день 1). в модифицированной среде Дульбекко Искова (Corning) с добавлением 10% FCS и l-глутамина. Для непрямых культур использовали Transwells с полиэфирной мембраной 0,4 мкм (Corning) для отделения Т-клеток от фибробластов и монослоев кератиноцитов. Нейтрализующие антитела к TGFβ (R&D Systems), E-кадгерину (Millipore), LFA-1 (BioLegend) и интегрину β ₁ (R&D Systems) и рекомбинантному человеческому TGFβ (R&D Systems) добавляли в систему сокультивирования до конечной концентрации. 10 мкг / мл.Т-клетки собирали промыванием на 6 день после начала сокультивирования. Прилипшие Т-клетки подсчитывали с помощью микроскопии и собирали, инкубируя лунки с трипсином / ЭДТА (Gemini Bio-Products) в течение 5 минут при 37 ° C.

CyTOF масс-цитометрический анализ Т-клеток периферической крови

Т-клетки были выделены из PBMC здоровых доноров путем истощения не-Т-клеток с использованием набора для изоляции Pan T и сепаратора autoMACS (Miltenyi Biotec). Т-клетки предварительно обрабатывали TAPI-2 (100 мкМ, Sigma-Aldrich) в течение 1 часа перед стимуляцией и в течение 4 часов стимуляции PMA / иономицином плюс брефельдином A для предотвращения индуцированного стимуляцией расщепления L-селектина ( 35 ) .После стимуляции Т-клетки окрашивали антителами, конъюгированными с поверхностным маркером, с металлами (MCA; Fluidigm Inc.) в концентрациях, которые оказались эффективными в предыдущих тестах на антитела. После окрашивания поверхности клетки фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали внутриклеточными антителами MCA в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем клетки метили в течение ночи при 4 ° C с помощью 125 нМ интеркалятора ДНК (Fluidigm Inc.). Наконец, клетки разбавляли до подходящей концентрации в дистиллированной воде, содержащей 10% калибровочных шариков EQ Four Element (Fluidigm Inc.) для достижения скорости сбора данных <500 событий в секунду на приборе CyTOF2 с использованием рекомендуемых настроек по умолчанию для CyTOF2 (Fluidigm Inc.). Данные CyTOF были нормализованы для гранул с помощью программного обеспечения CyTOF2 после сбора без удаления гранул и с использованием настроек по умолчанию (Fluidigm Inc.). После того, как встроенное программное обеспечение для идентификации клеток создало файл FCS, данные CyTOF были проанализированы аналогично стандартному анализу проточной цитометрии с помощью программного обеспечения FCS Express 4.0 (De Novo Software) с использованием содержания ДНК и гранул нормализации для идентификации единичных клеточных событий.

Статистический анализ

Основные методы анализа данных включали описательную статистику (средние, медианы и стандартное отклонение). Различия между двумя группами образцов были обнаружены с помощью одностороннего критерия Вилкоксона-Манна-Уитни, α = 0,05. Для сравнения нескольких групп использовали однофакторный дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса с посттестом Бонферрони-Данна для критерия множественных средних, α = 0,05.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

www.sciencetranslationalmedicine.org/cgi/content/full/7/279/279ra39/DC1

Рис.S1. Инфильтрация Т-клеток у мышей с привитыми людьми.

Рис. S2. Эпидермальные Т-клетки потеряли функциональную активность и подверглись апоптозу после удаления из микроокружения кожи.

Рис. S3. Подмножество Т-клеток CCR7 ⁺ в дерме человека экспрессируют CD69, а небольшое подмножество Т _RM кожи коэкспрессируют L-селектин.

Рис. S4. Стратегия стробирования и репрезентативные гистограммы для данных, показанных на фиг. 6C.

Рис. S5. Таблицы первичных данных для рис.1-8.

Рис. S6. Изотипические контроли для иммунофлуоресцентных изображений для фиг. 1, 3 и 6.

Рис. S7. Стратегия гейтинга и изотипические контроли для исследований проточной цитометрии, показанные на фиг. С 1 по 8.

Благодарности: Мы хотели бы поблагодарить пациентов, которые сделали эту работу возможной, как за то, что доверили нам свою клиническую помощь, так и за сдачу образцов кожи и крови. A-dmDT (390) -bisFv (UCHT1) был предоставлен J.-H. Ву (Отделение внутренней медицины, Мемориальная больница Скотта и Уайта, Медицинский колледж, Научный центр здоровья Техасского университета A&M), Д.Невилл (Отделение биофизической химии, Лаборатория молекулярной биологии, Национальный институт психического здоровья) и А. Э. Франкель (отделение медицины, Комплексный онкологический центр Симмонса, Юго-западный медицинский центр Юта). T. Cochran (Бостонский центр пластической хирургии) и B. Pomahac, S. Talbot и E. Eriksson (Brigham and Women’s Hospital) предоставили образцы кожи взрослого человека. Мы благодарим Дж. Мерфи (заведующий отделением дерматопатологии отделения патологии больницы Бригама и женщин) за его помощь в фотографировании гистологических срезов. Финансирование: Эта работа была поддержана щедрым благотворительным взносом Эдварда П. Лоуренса, эсквайра, R01 AR063962 NIH / Национального института артрита, скелетно-мышечных и кожных заболеваний (NIAMS) (RAC), R01 AR056720 NIH / NIAMS (to RAC), награду за клинические исследования Дэймона Руньона (для RAC), SPORE в раке кожи P50 CA9368305 NIH / Национального института рака (для TSK) и R01 AI097128 Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (для TSK и RAC). Заработная плата R.W. была предоставлена ​​за счет специального гранта для ученых от Общества лейкемии и лимфомы.Заработная плата C.S. была предоставлена ​​Швейцарским национальным научным фондом и Фондом Рене Турена. Вклад авторов: R.A.C. планировал и контролировал эксперименты, анализировал данные, готовил рисунки и составлял рукопись. R.W. планировал и проводил эксперименты, анализировал данные, проводил статистический анализ, готовил цифры и предоставлял клинические данные. A.G., C.Y., L.L.S., J.E.T., C.S., T.R.M. и V.H. помогали в проведении экспериментов, а J.E.T. также оказывала редакционную помощь.C.P.E. помогал в составлении рисунков. Т.С.К. предоставил образцы пациентов CTCL и рекомендации по экспериментальным подходам. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

• Авторские права © 2015, Американская ассоциация развития науки

Микробиом кожи человека | Nature Reviews Microbiology

Волосатая кожа человека, полностью образованная из плюрипотентных стволовых клеток